Identifizierung immunodominanter Antigene von Helicobacter pylori:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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2000
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| Beschreibung: | Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2001 |
| Beschreibung: | 108 Bl. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 3
2. EINLEITUNG 5
2.1. DIE ART
HELICOBACTER PYLORI.5
2.2. VIRULENZFAKTOREN VON HELICOBACTER PYLORI.7
2.3. DIAGNOSE UND THERAPIE.11
2.4. WIRTSZELLANTWORT UND IMPFSTOFFENTWICKLUNG.13
2.5. ZIELSETZUNG. 17
3. MATERIAL 18
3.1. BAKTERIENSTAEMME.18
3.2. ZELLINIE.18
3.3. ANTI-HELICOBACTER PYLORI-SEREN.18
3.4. KONTROLLSEREN VON H. PYLORI-NEGATIVEN INDIVIDUEN.19
3.5. VEKTOREN UND REKOMBINANTE PLASMIDE.19
3.6. OLIGONUKLEOTIDE.20
3.7. MEDIEN UND AGARPLATTEN.21
3.7.1. MEDIEN.21
3.7.2. MEDIENZUSAETZE.22
3.8. CHEMIKALIEN UND ENZYME.22
3.9. GERAETE.'.22
4. METHODEN 23
4.1. SPALTUNG VON DNA MIT HILFE VON RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.23
4.2. HORIZONTALE AGAROSEGELELEKTROPHORESE.,.23
4.3. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA. 23
4.3.1. PLASMID-DNA-PRAEPARATION IM MITTLEREN MASSSTAB: NUCLEOBOND-AX-KIT
VON MACHERY-NAGEL.23
4.3.2. PLASMID-DNA-PRAEPARATION IM KLEINEN MASSSTAB (MINIPRAEPARATION).23
4.4. DNA-ISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN MITTELS QIAQUICK-EXTRAKTIONSKIT VON
QIAGEN . 24
4.5. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.24
4.6. LIGATION DER PLASMIDFRAGMENTE.24
4.7. ANZUCHT VON HELICOBACTER PYLORI. 24
4.8. TRANSFORMATION. 24
4.8.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN VON
E. COLI.24
4.8.2. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN VON S. TYPHIMURIUM. 24
4.8.3. TRANSFORMATION VON E. COLI UND S. TYPHIMURIUM. 25
4.8.4. TRANSFORMATION VON NATUERLICH KOMPETENTEN H. PYLORI-STAEMMEN. 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.9. AMPLIFIKATION VON DNA MITTELS POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 25
4.10. PCR MIT BAKTERIENLYSATEN. 25
4.11. REINIGEN VON PCR-PRODUKTEN UEBER QIAQUICK-SPIN SAEULCHEN (QIAGEN).26
4.12. AUTOMATISCHE DNA-SEQUENZIERUNG.26
4.13. SOUTHEMBLOT.26
4.13.1. ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS
H. PYLORI IM MINI-MASSSTAB. 26
4.13.2. SOUTHEMBLOT MIT DER CHEMILUMINESZENZ (ECL)-METHODE. 26
4.14. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(SDS-PAQE). 27
4.15. PROTEINISOLIERUNG. 28
4.15.1. PROTEINISOLIERUNG AUS DEM KULTURUEBERSTAND DURCH FAELLUNG MIT
TRICHLORESSIGSAEURE (TCA).28
4.15.2. ISOLIERUNG VON GESAMTZELLPROTEINEN VON H. PYLORI. 28
4.15.3. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION MIT DEM
BIO-RAD-PROTEIN-ASSAY. 28
4.16. ZWEIDIMENSIONALE PROTEINGELELEKTROPHORESE. 28
4.16.1. AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IN DER ERSTEN DIMENSION DURCH
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG (IEF) IN ROEHRCHENGELEN. 29
4.16.2. AUFTRENNUNG DER PROTEINE IN DER ZWEITEN DIMENSION DURCH
SDS-POLYACRYL-
AMID-GELELEKTROPHORESE.30
4.17. PROTEINFARBUNG.31
4.17.1. FAERBEN VON POLYACRYLAMID-GELEN MIT KOLLOIDALEM COOMASSIE-BLAU.31
4.17.2. FAERBEN DER PROTEINE MIT SILBEMITRAT.31
4.18. IMMUNOBLOT-ANALYSE VON PROTEINEN.31
4.18.1. ELEKTROBLOT.31
4.18.2. TANKBLOT.32
4.19. ZELLKULTUR.32
4.19.1. ZELLKULTUR MIT PERMANENTEN ZELLINIEN. 32
4.19.2. PASSAGIEREN VON ADHARAENTEN J774-MAKROPHAGEN. 32
4.19.3. BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL MIT TRYPANBLAU. 33
4.19.4. INFEKTION VON J774-MAKROPHAGEN MIT S. TYPHIMURIUM.33
4.20. ARBEITEN MIT RNA .^. 33
4.20.1. ISOLIERUNG VON RNA.33
4.20.2. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA. 34
4.21. REVERSE TRANSKRIPTION UND ANSCHLIESSENDE PCR MIT CDNA. 34
5. ERGEBNISSE / 35
5.1. IDENTIFIZIERUNG IMMUNODOMINANTER ANTIGENE VON
HELICOBACTER PYLORI DURCH DIE
YYPROTEOM"-TECHNOLOGIE.35
5.1.1. ANALYSE DER GESAMTZELLPROTEINLYSATE VON
H. PYLORI G27.35
5.1.2. ANALYSE DER UEBERSTANDSPROTEINE VON H. PYLORI G27.43
5.2. VERGLEICH DER MIT VERSCHIEDENEN PATIENTENSEREN ERHALTENEN
ANTIGENMUSTER VON
H. PYLORI G27-PIOTEINLYSATEN.44
5.3. PROTEOMANALYSEN MIT KLINISCHEN H. PYLORI-LSOFOTEN.AL
5.3.1. IDENTIFIZIERUNG IMMUNODOMINANTER ANTIGENE.48
5.4. EXPRESSION DER H. PYLORI-ANTIGENE ZUR KONSTRUKTION REKOMBINANTER
LEBENDIMPFSTOFFE.54
5.4.1. KLONIERUNG VON
H PYLORI-GENEN IN DEN SEKRETIONSVEKTOR PMOHLYL.55
5.4.2. UEBERPRUEFUNG DER SEKRETION DER FUSIONSPROTEINE. 58
5.5. ANALYSEN ZUR PROTEKTIVITAET DES NEUTROPHILEN-AKTIVIERUNGSPROTEINS
NAPA. 61
5.5.1. KONSTRUKTION EINER NA/?A-MUTANTE. 61
5.5.2. EXPRESSION VON NAPA UNTER KONTROLLE DES W'RB-PROMOTORS. 64
5.5.2.1. KONSTRUKTION VON PNIRB-NAPA.64
5.5.2.2. INFEKTION VON J774-MAKROPHAGEN MIT REKOMINANTEN
S. TYPHIMURIUM
SL7207. 65
5.5.2.3. NACHWEIS APA-SPEZIFISCHER TRANSKRIPTE DURCH RT-PCR.67
5.5.3. PROTEKTIVE WIRKUNG VON NAPA IM MAUSMODELL.68
5.5.3.1. IMMUNISIERUNG DER MAEUSE.68
5.5.3.2. SPEZIFISCH GEGEN NAPA GERICHTETE ANTIKOERPERANTWORT.70
5.5.4. UNTERSUCHUNG DER GEGEN NAPA GERICHTETEN HUMANEN IGG-ANTWORT.72
6. DISKUSSION 74
7. LITERATURVERZEICHNIS 92
8. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 105
9. ANHANG
107 |
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