In-vitro- und in-vivo-Studien zur Funktion des Tumorsuppressorgens wt 1:
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Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
2000
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|---|---|
| adam_text | Inhalt
1 Einleitung 1
1.1 Krebs und Gene 1
1.2 Tumorsuppressorgene 2
1.3 Wilms Tumor und WT1 2
1.4 WT1 Mutationen und damit assoziierte Krankheiten 3
1.5 Struktur und Isoformen von WT1 4
1.6 Das Expressionsmuster von WT1 und seine Rolle während der
Embryonalentwicklung 7
1.7 Zielgene von WT1 9
1.8 RNA Bindung und Spleißen durch WT1? 11
1.9 WTl interagierende Proteine 12
1.10 Der Einfluß von WT 1 auf Zeilproliferation und Apoptose 14
1.11 Fragestellung 15
2 Material und Methoden 17
2.1 Material 17
2.1.1 Bezugsquellen 17
2.1.2 Radiochemikalien 19
2.1.3 Enzyme 19
2.1.4 Bakterienstämme und eukaryontische Zellinien 19
2.1.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen 20
2.1.6 Plasmide 21
2.1.7 Oligonukleotide 22
2.1.8 Antikörper 23
2.1.9 Mausstämme 24
Inhalt
2.2 Methoden 24
2.2.1 Allgemeine Methoden zur Behandlung von Nukleinsäuren 24
2.2.2 Klonierungstechniken 25
2.2.3 Transformation von Bakterien 26
2.2.4 Präparation von rekombinanter Plasmid DNA aus
transformierten Bakterien 26
2.2.5 Sequenzierung von DNA und Auftrennung der
Sequenzierprodukte 27
2.2.6 Zellkultur 28
2.2.7 Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation spezifischer
Sequenzen aus genomischer DNA 28
2.2.8 Allgemeine Methoden zur Behandlung von Proteinen 29
2.2.8.1 Probenerstellung für SDS PAGE 29
2.2.8.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 29
2.2.8.3 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen
über SDS Polyacrylamidgele 29
2.2.9 Methoden zum Nachweis spezifischer Proteine 30
2.2.9.1 Immunzytochemische Färbung von Zellen 30
2.2.9.2 Transfer von Proteinen auf Membranen und
Detektion mit spezifischen Antikörpern
(Westernbloi) 31
2.2.9.3 Radioaktive Markierung und anschließende
Immunpräzipitation von Proteinen 31
2.2.9.4 Phosphoaminosäureanalyse 32
2.2.9.5 Phosphopeptidanalyse 33
2.2.10 Methoden zur Präparation von Mäusen und Analyse von
Mausgeweben 34
2.2.10.1 Verpaaren der Mäuse und Bestimmung der
embryonalen Entwicklungsstadien 34
2.2.10.2 Genotypisierung von knock ow/ Mäusen 34
Inhalt
2.2.10.3 Isolation von Mausembryonen 35
2.2.10.4 Blastozystentransfer 35
2.2.11 Anfertigung und Analyse von histologischen Schnitten 36
2.2.11.1 Beschichten von Objektträgern 36
2.2.11.2 Einbetten und Anfertigung von histologischen
Schnitten 36
2.2.11.3 Entparaffinierung, Färbung und Entwässerung
der Schnitte 37
2.2.12 Nachweis apoptotischer Zellen anhand des TUNEL Assays
unter Verwendung des ApopTag Plus Peroxidase Kits
(Appligene, Heidelberg) 37
2.2.13 Immunhistochemische Expressionsanalyse 38
2.2.14 In s/Yw Hybridisierung embryonalen Gewebes (whole mounts) 38
3 Ergebnisse 41
3.1 Die S/ ec£//«g Domäne von Wtl umfaßt die Aminosäuren 76 120 41
3.1.1 Identifizierung der Speckling Domme 43
3.1.2 Die Aminosäuren 84 177 sind notwendig und ausreichend für
die Lokalisation von Wtl in Speckies 45
3.2 Posttranslationelle Modifikation von Wtl durch Phosphorylierung 49
3.2.1 Phosphorylierung von Wildtyp und mutantem Wtl 49
3.2.2 Wtl ist an den Aminosäuren Serin und Threonin
phosphoryliert 50
3.2.3 Phosphopeptidanalyse von Wildtyp und mutantem Wtl 52
3.2.4 Wtl ist an multiplen Stellen phosphoryliert 53
3.3 Wtl ist notwendig für die Entwicklung der Milz 56
3.3.1 Der mit der Inaktivierung von wtl assoziierte Phänotyp ist
vom genetischen Hintergrund abhängig 56
Inhalt
3.3.2 In wtl defizienten Embryonen findet keine Entwicklung
der Milz statt 57
3.3.3 Wtl ist ein antiapoptotischer Faktor 60
3.3.4 Während der Milzentwicklung werden wtl und hoxl 1
unabhängig voneinander reguliert 63
4 Diskussion 66
4.1 Lokalisation von Wtl (+KTS) in Speckies 67
4.1.1 Die Identifikation der Speckling Domäne von Wt 1 67
4.1.2 Die Speckling Domäne als Mittel zur Analyse der Funktion
von wtl 69
4.1.3 Dienen die Speckies als Depot für Wt 1 (+KTS) Isoformen? 70
4.2 Wtl ist posttranslationell modifiziert 71
4.3 In vivo Studien zur Funktion von wtl 74
4.3.1 Der Einfluß modifizierender Gene 74
4.3.2 Die Rolle von Wtl bei der Milzentwicklung 75
4.3.3 Wtl ein antiapoptotischer Faktor? 76
5 Abkürzungen 78
6 Literatur 80
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