Intrazelluläre Überlebensmechanismen von Bordetella-Arten in professionellen Phagozyten:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
A SUMMARY / ZUSAMMENFASSUNG 1
B EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 3
1 DIE GATTUNG
BORDETELLA 3
1.1 HISTORISCHES 4
1.2
BORDETELLA PERTUSSIS 4
1.3
BORDETELLA BRONCHISEPTICA 5
1.4
BORDETELLA PARAPERTUSSIS 6
1.5 DIE WEITEREN
BORDETELLA-ARTEN 6
2 VIRULENZ-REGULATION DURCH DAS BVGAS-ZWEH 7
KOMPONENTEN SYSTEM
2.1 PHASENVARIATION UND PHAENOTYPISCHE MODULATION 7
2.2 DAS BVG-ZWEI-KOMPONENTEN SYSTEM 8
2.3 BVG-AKTIVIERTE FAKTOREN 11
2.4 BVG-REPRIMIERTE FAKTOREN 14
2.5 FAKTOREN DER BVG'-PHASE 16
2.6 DIE BEDEUTUNG DES BVG-SYSTEMS
IN VIVO 16
3 INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN 17
3.1 PHAGOZYTOSE UND PHAGOSOMENREIFUNG 17
3.1.1 ANSAEUERUNG IM PHAGOLYSOSOM 19
3.1.2 DEFENSINE 19
3.2 WEGE INTRAZELLULAEREN UEBERLEBENS 20
3.2.1 VERHINDERUNG DER FUSION VON PHAGOSOMEN MIT LYSOSOMEN 20
3.2.2 ENTKOMMEN AUS DEM PHAGOSOM 21
3.2.3 SCHUTZ VOR DEGRADATION 22
3.2.4 ANSAEUERUNG UND INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN 23
3
3 DAS INTRAZELLULAERE UEBERLEBEN VON BORDETELLEN 23
4 SAEURESTRESS 25
4.1 SAEURERESISTENZ 25
5 ZIELSETZUNG 27
C MATERIALIEN UND METHODEN 28
1 BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE, OLIGONUKLEOTIDE UND 28
ANTIKOERPER
1.1 BAKTERIENSTAEMME 28
1.2 PLASMIDE 30
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
13 OLIGONUKLEOTIDE 30
1.4 ANTIKOERPER 31
2 MEDIEN UND LOESUNGEN 31
2.1 WACHSTUMSMEDIEN 31
2.1.1 MEDIEN UND AGARPLATTEN FUER
E. COLI UND S. TYPHIMURIUM 31
2.1.2 MEDIEN UND AGARPLATTEN FUER
BORDETELLA SPEC. 32
2.2 ANTIBIOTIKA-LOESUNGEN 32
23 LOESUNGEN UND PUFFER 33
2.4 ZELLEN UND ZELLKULTUR-REAGENZIEN 33
3 MATERIALIEN UND GERAETE 34
3.1 MATERIALIEN 34
3.2 GERAETE 34
4 ALLGEMEINE METHODEN 35
4.1 ABSORPTIONSMESSUNG
X ~ 35
42 BESTIMMUNG DER GENERATIONSZEIT 35
43 SAEURETOLERANZ-TEST 36
5 GENETISCHE METHODEN 36
5.1 TRANSFORMATION VON
K COLI 36
5.1.1 STANDARDMETHODE NACH COHEN
ET AL. 36
5.1.1.1 HERSTELLUNG DAUERKOMPETENTER E. COLI-ZELLEN 36
5.1.1.2 TRANSFORMATION 36
5.2 KONJUGATION MIT
BORDETELLA BRONCHISEPTICA 37
53 ANLEGEN VON GLYCERIN-DAUERKULTUREN 37
5.4 TRANSPOSON-MUTAGENESEN 37
5.4.1 MUTAGENESE MIT TNPHOA 38
5.4.2 MUTAGENESE RFIIT TNGFP 38
6 ARBEITEN MIT DNA 38
6.1 ISOLIERUNG VON DNA 38
6.1.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA MIT ALKALISCHER LYSE IM KLEINEN 38
MASSSTAB
/
6.1.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA NACH HOLMES UND QUIGLEY 39
6.1.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM MITTLEREN MASSSTAB 39
6.1.4 ISOLIERUNG VON CHROMOSOMALER DNA AUS
BORDETELLA 40
6.1.5 SCHNELLPRAEPARATION CHROMOSOMALER DNA AUS BORDETELLEN IN 40
KLEINEM MASSSTAB
6.2 SPEZIFISCHE ENZYMATISCHE HYDROLYSE VON DNA 41
63 ELEKTROPHORESE VON DNA IN AGAROSEGELEN 41
6.3.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 41
6.3.2 PULSFELD-GELELEKTROPHORESE (PFGE) 41
6.3.2.1 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA IN AGAROSEBLOECKCHEN 41
6.3.2.2 RESTRIKTIONSVERDAU UND GELELEKTROPHORESE 42
6.4 REINIGUNG UND FAELLEN VON DNA 42
INHALTSVERZEICHNIS
III
6.4.1 PHENOLEXTRAKTION 42
6.4.2 ETHANOLFAELLUNG 42
6.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 42
6.6 EXTRAKTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 43
6.6.1 EXTRAKTION UEBER DEN QI AQUICK GEL EXTRACTION KIT 43
6.6.2 KALTE PHENOLEXTRAKTION 43
6.7 DNA-AMPLIFIZIERUNG MITTELS PCR 43
6.7.1 ROHLYSATE ALS MATRIZE FUER DIE PCR 44
6.7.2
INVERSE PCR (TRIGLIA ET AL., 1988) 44
6.7.3 REINIGUNG DES AMPLIFIZIERTEN PCR-PRODUKTES 45
6.8 AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG 45
6.9 SOUTHERN-BLOT 45
6.9.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND PROZESSIERUNG DES GELS 45
6.9.2 DNA-TRANSFER AUF DIE NYLONMEMBRAN (KAPILLARBLOT) 46
6.9.3 HYBRIDISIERUNG UND ENTWICKLUNG DES BLOTS 46
7 DIE GENETISCHE CHARAKTERISIERUNG VON TRANSPOSON- 46
MUTANTEN
7.1 BB MU4 46
7.2 BB UP9, BB SD9, BB SU2, BB SU5, BB SU6, BB SU8, BB 46
SU11, BB SU 13, BB SU14, BB SU17, BB SU18, BB SU27
UND BB SU30
7.3 BB SU9 47
7.4 BB GFP+ UND BB REDL 47
7.5 BB PS2 47
8 COMPUTERGESTUETZTE ANALYSEN 47
8.1 SEQUENZANALYSEN 47
8.2 SIGNIFIKANZ-TESTS 48
T
9 KULTUR TIERISCHER ZELLEN 48
9.1 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 48
9.1.1 EINFRIEREN DER ZELLEN 48
9.1.2 AUFTAUEN DER ZELLEN 48
9.2 INFEKTION VON MH-S-MAKROPHAGEN / 48
9.2.1 EINSTELLEN DER MAKROPHAGEN FUER DIE INFEKTION 48
9.2.2 EINSTELLEN DER BAKTERIENZELLZAHL FUER DIE INFEKTION 49
9.2.3 INFEKTION DER MAKROPHAGEN UND BESTIMMUNG DER 49
INTRAZELLULAEREN UEBERLEBENSRATE
9.3 BESTIMMUNG DES PHAGOSOMALEN PH-WERTES 49
9.3.1 FLUORESZENZ-MARKIERUNG VON BAKTERIEN 49
6.3.2 INFEKTION UND BESTIMMUNG DES PHAGOSOMALEN PH-WERTES UEBER 49
FLUORESZENZMESSUNGEN
9.4 FLUORESZENZ-MIKROSKOPIE 50
10
ARBEITEN MIT PROTEINEN
51
10.1 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 51
INHALTSVERZEICHNIS
IV
10.1.1 BESTIMMUNG DER RELATIVEN FLUORESZENZ (GFP-AKTIVITAET) 51
D ERGEBNISSE 52
1 INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN VON BORDETELLEN 52
1*1 INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN VON BORDETELLEN IN ALVEOLAREN 52
MAKROPHAGEN DER MAUS
1*2 CHARAKTERISIERUNG DES
BORDETELLA-HALTIGEN PHAGOSOMS 52
2 UNTERSUCHUNGEN ZUR SAEURETOLERANZ DER BORDETELLEN 56
2.1 ANSAEUERUNG IM
BORDETELLA-HALTIGEN PHAGOLYSOSOMEN 56
2.2
IN VITRO SAEURETOLERANZ VON BORDETELLEN 58
2.2.1 BESTIMMUNG DER MINIMALEN PH-WACHSTUMSGRENZE VON 59
BORDETELLEN
2.2.2 BESTIMMUNG DER SAEURETOLERANZ VON BORDETELLEN 59
23 UNTERSUCHUNGEN ZUR SAEUREADAPTION VON BORDETELLEN 60
2.4 EINFLUSS DER ANSAEUERUNG IM PHAGOLYSOSOM AUFDAS 61
INTRAZELLULAERE UEBERLEBENSPOTENTIAL VON BORDETELLEN
2.4.1 INHIBIEREN DER ANSAEUERUNG IM PHAGOSOM DURCH BAFILOMYCIN 61
2.4.2 NEUTRALISIERUNG DER ANSAEUERUNG IM PHAGOSOM DURCH 61
AMMONIUMCHLORID
2.4.3 AEQUILIBRIERUNG VON INTRAZELLULAEREM UND EXTRAZELLULAEREM PH 62
DURCH MONENSIN
2.4.4 NEUTRALISIERUNG DER ANSAEUERUNG IM PHAGOSOM DURCH 62
METHYLAMIN
3 SUCHE NACH AN DER SAEURERESISTENZ BETEILIGTEN GENEN 64
IN
B. BRONCHISEPTICA
3.1 SUCHE NACH AM UEBERLEBEN IM SAUREN MILIEU BETEILIGTEN 64
GENEN IN
B. BRONCHISEPTICA
3.2 SUCHE NACH IM SAUREN MILIEU INDUZIERTEN GENEN IN
B. 66
BRONCHISEPTICA
3.3 SUCHE NACH AN DER SAEURERESISTENZ BETEILIGTEN GENEN
IN 69
SILICO
3.4 CHARAKTERISIERUNG DIVERSER
B. BRONCHISEPTICA-MUTANTEN 69
3.4.1 SAEURERESISTENZ DER MUTANTEN 69
3.4.2 INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN DER MUTANTEN 70
4 BVG-NEGATIV REGULIERTE GENE IN SS.
BRONCHISEPTICA 70
4.1 IDENTIFIZIERUNG SULFAT-AKTIVIERTER GENE IN
B. BRONCHISEPTICA 70
4.2 GENETISCHE ORGANISATION SULFAT-AKTIVIERTER GENE 72
4.2.1 DIE MUTANTE BB SU2 72
4.2.2 DIE MUTANTEN BBSU5,BBSU13 UND BBSU18 73
4.2.3 DIE MUTANTEN BB SU6, BB SU14 UND BB SU27 75
4.2.4 DIE MUTANTE BB SU8 76
4.2.5 DIE MUTANTE BB SU9 77
4.2.6 DIE MUTANTE BB SU11 78
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.2.7 DIE MUTANTE BB SU 17 79
4.2.8 DIE MUTANTE BB SU30 80
4.3 CHARAKTERISIERUNG SULFAT-AKTIVIERTER
B. BRONCHISEPTICA- 81
MUTANTEN
4.3.1 FLUORESZENZMESSUNG DER MUTANTEN MIT UND OHNE SULFAT 82
4.3.2 VERGLEICH UNTERSCHIEDLICHER MODULIERENDER BEDINGUNGEN 83
4.3.3 INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN DER MUTANTEN 84
4.4 DIE REGULATION BVG-REPRIMIERTER GENE 85
5 APPENDIX: CHARAKTERISIERUNG VON SS.
BRONCHISEPTICA- 86
MUTANTEN MIT INTERESSANTEM PHAENOTYP
5.1 DURCH TNGFP-MUTAGENESE ERHALTENE MUTANTEN 87
5.1.1 CHARAKTERISIERUNG EINER STARK GRUEN-FLUORESZIERENDEN MUTANTE 87
VON B. BRONCHISEPTICA
5.1.2 CHARAKTERISIERUNG EINER ROT-FLUORESZIERENDEN MUTANTE VON B. 87
BRONCHISEPTICA
5.2 WEITERFOHRENDE CHARAKTERISIERUNG EINER PROTAMIN- 89
SENSITIVEN MUTANTE VON
B. BRONCHISEPTICA
5.2.1 GENETISCHE CHARAKTERISIERUNG 90
5.2.2 UNTERSUCHUNGEN IM MAUSMODELL 92
E DISKUSSION 93
1 MOLEKULARBIOLOGISCHE ASPEKTE DES INTRAZELLULAEREN 93
UEBERLEBENS VON
BORDETELLA ARTEN IN ALVEOLAREN
MAKROPHAGEN DER MAUS
1.1 DAS BORDETELLA-HALTIGE PHAGOSOM 93
1.2 ANSAEUERUNG UND INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN 94
2 GENETISCHE ASPEKTE DES INTRAZELLULAEREN UEBERLEBENS 97
VON SS.
BRONCHISEPTICA
2.1 SAEURERESISTENZ UND INTRAZELLULAERES UEBERLEBEN VON
B. 97
BRONCHISEPTICA
2.2 DIE BEDEUTUNG DES BVG-SYSTEMS 100
2.2.1 BVG-REPRIMIERTE GENE MIT MOEGLICHER BETEILIGUNG AM 100
ENERGIESTOFFWECHSEL
2.2.2 WEITERE BVG-REPRIMIERTE GENE 102
2.2.3 DIE BEDEUTUNG BVG-REPRIMIERTER GENE 103
2.2.4 MOLEKULARE REGULATIONSMECHANISMEN BVG-REPRIMIERTER GENE 104
3 SONSTIGES 106
3.1 TRANSPOSONMUTAGENESEN 106
3.2 GRUEN- ODER ROT-FLUORESZIERENDE MUTANTEN 107
3.3 DIE PROTAMIN-SENSITIVE MUTANTE BB PS2 108
INHALTSVERZEICHNIS
VI
F LITERATURVERZEICHNIS 109
G ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 128
H ANHANG 129
1 FIGUREN-LEGENDE 129
2 SEQUENZEN 129
3 PUBLIKATIONEN 132
4 LEBENSLAUF
133 |
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