Der Einfluß von Mutationen im aktiven Zentrum der Dipeptidylpeptidase IV, CD26 auf Enzymaktivität, Proteinstabilität und subzelluläre Lokalisation:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
.
SEITE
1
EINLEITUNG
.
7-22
1.1
AKTIVITAET
UND
STRUKTUR
DER
DPPIV
.
7
1.2
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
UND
INTRAZELLULAERER
TRANSPORT
.
9
1.3
GEWEBEVERTEILUNG
.
10
1.4
FUNKTIONEN
DER
DPP
IV
.
15
1.4.1
ENTERALE
PROTEINRESORPTION
UND
RENALE
PEPTIDRUECKGEWINNUNG
.
15
1.4.2
DIE
REGULATION
BIOAKTIVER
PROTEINE
UND
PEPTIDE
DURCH
DPP
IV
VERMITTELTE
PROTEOLYSE
.
16
1.4.3
ZELL-MATRIX
INTERAKTION
.
18
1.4.4
DIE
ROLLE
DER
DPP
IV
IN
DER
IMMUNABWEHR
.
19
2.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
23
3.
ERGEBNISSE
.
24-44
3.1
AUFARBEITUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DER
PLASMIDE
.
26
3.1.1
AUFARBEITUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
PLASMIDS
PRC/CMV
DPP
IV-
WILDTYP
.
27
3.1.2
AUFARBEITUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
PLASMIDS
PRC/CMV
DPP
IV
SER
63L
- ALA
.
28
3.1.3
AUFARBEITUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
PLASMIDS
PRC/CMV
DPP
IV
ASP
709
- ASN
.
29
3.1.4
AUFARBEITUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
PLASMIDS
PRC/CMV
DPP
IV-A
719-767
.
29
3.2
STABILE
TRANSFEKTION
DER
DPP
IV-KONSTRUKTE
IN
CHO-ZELLEN
.
31
3.2.1
KLONIERUNG
DPP
IV-WILDTYP-TRANSFIZIERTER
CHO-ZELLEN
.
31
3.2.2
KLONIERUNG
DPP
IV-SER
631
- ALA
-TRANSFIZIERTER
CHO-ZELLEN
.
32
3.2.3
KLONIERUNG
DPP
IV
ASP
709
-ASN
-TRANSFIZIERTER
CHO-ZELLEN
.
33
3.2.4
KLONIERUNG
DPP
IV-A
719-767
-TRANSFIZIERTER
CHO-ZELLEN
.
35
3.3
UNTERSUCHUNG
DER
TRANSFIZIERTEN
DPP
IV
UND
IHRER
MUTANTEN
HINSICHTLICH
PROTEINEXPRESSION,
MRNA-EXPRESSION,
SUBZELLULAERER
LOKALISATION,
PROTEINSTABILITAET
UND
PROTEASEAKTIVITAET
.
37
3.3.1
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEINEXPRESSION
TRANSFIZIERTER
DPP
IV
UND
IHRER
MUTANTEN
.
37
3.3.2
UNTERSUCHUNG
DER
MRNA-EXPRESSION
TRANSFIZIERTER
DPP
IV
UND
IHRER
MUTANTEN
.
38
3.3.3
NACHWEIS
DER
SUBZELLULAEREN
LOKALISATION
DER
DPP
IV
UND
IHRER
MUTANTEN
.
38
3.3.4
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEINSTABILITAET
TRANSFIZIERTER
DPP
IV
UND
IHRER
MUTANTEN
.
42
3.3.5
UNTERSUCHUNG
DER
PEPTIDASEAKTIVITAET
TRANSFIZIERTER
DPP
IV
UND
IHRER
MUTANTEN
.
44
4.
DISKUSSION
.
45
4.1
DER
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
IM
KATALYTISCH
AKTIVEN
ZENTRUM
DER
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
AUF
ENYZMAKTIVITAET,
PROTEINSTABILITAET
UND
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
.
45
4.1.1
DAS
KATALYTISCH
AKTIVE
ZENTRUM
DER
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
.
45
4.1.2
DER
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
AUF
EXPRESSION,
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
ENZYMEN
.
'.
.
46
4.1.3
DER
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
IM
AKTIVEN
ZENTRUM
DER
DIPEPTIDYL
PEPTIDASE
IV
AUF
DIE
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
.
47
4.1.4
DER
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
IM
AKTIVEN
ZENTRUM
DER
DIPEPTIDYL
PEPTIDASE
IV
AUF
DIE
PROTEINSTABILITAET
.
48
4.1.5
DER
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
IM
AKTIVEN
ZENTRUM
DER
DIPEPTIDYL
PEPTIDASE
IV
AUF
DIE
EMZYMATISCHE
AKTIVITAET
.
49
4.2
CHARAKTERISIERUNG
STRUKTURELLER
UND
FUNKTIONELLER
DOMAENEN
DER
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
.
49
4.3
DIE
BEDEUTUNG
DER
PEPTIDASEAKTIVITAET
FUER
DIE
FUNKTIONEN
DER
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
.
51
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
53
6.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
54
6.1
MATERIALIEN
.
54
6.1.1
GERAETE
.
54
6.1.2
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSWAREN
.
55
6.1.3
NAEHRMEDIEN
.
55
6.1.3.1
NAEHRMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
.
55
6.1.3.2
NAEHRMEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
55
6.1.4
ANTIKOERPER
.
56
6.1.5
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
56
6.1.5.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
56
6.1.5.1.1
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
56
6.1.5.1.2 LOESUNGEN
FUER
DIE
TRANSFORMATION
.
57
6.1.5.1.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
PLASMIDISOLIERUNG
.
57
6.1.5.1.4
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
RNA-ISOLIERUNG
.
58
6.1.5.1.5
PUFFER
UND
LOESUNGEN
ZUR
DNA/RNA-GELELEKTROPHORESE
.
58
6.1.5.1.6
PUFFER
FUER
DEN
NORTHERN-BLOT
.
59
6.1.5.1.7
LOESUNGEN
ZUR
HYBRIDISIERUNG
.
59
6.1.5.3.8
PUFFER
ZUR
AUFREINIGUNG
VON
RADIOAKTIVEN
SONDEN
.
59
6.1.5.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
60
6.1.5.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
60
6.1.5.3.1
LOESUNGEN
FUER
DIE
DPP
IV-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
60
6.1.5.3.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
60
6.1.5.3.3
WASCHLOESUNGEN
FUER
DIE
IMMUNPRAEZIPITATION
.
61
6.1.5.3.4
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DEN WESTEM-BLOT
.
61
6.1.5.3.5
LOESUNGEN
FUER
DIE
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
BEIM
WESTEM-BLOT
.
61
6.1.5.3.6
PUFFER
FUER
DIE
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
(FACS-PUFFER)
.
62
6.1.5.3.7
LOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
DIE
IMMUNFLUORESZENZ
.
62
6.1.5.3.8
LOESUNGEN
FUER
PULSE-CHASE-EXPERIMENTE
.
62
6.1.6
RADIOCHEMIKALIEN
.
62
6.1.7
FILME
.
62
6.1.8
BAKTERIENSTAMM
.
63
6.1.9
ZELLINIE
.
63
6.2
METHODEN
.
63
6.2.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
63
6.2.1.1
DNA-GEWINNUNG
.
63
6.2.1.2
PHENOLEXTRAKTION
.
65
6.2.1.3
ETHANOLFAELLUNG
/
ISOPROPANOLFAELLUNG
.
65
6.2.1.4
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
66
6.2.1.5
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG
.
66
6.2.1.6
DNA-ELEKTROPHORESE
.
67
6.2.1.6.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
FUER
DNA
.
67
6.1.2.6.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
67
6.1.2.7
TRANSFORMATION
VON
PLASMIDEN
IN
BAKTERIEN
.
68
6.2.1.8
ANLEGEN
VON
GLYZERINKULTUREN
.
69
6.2.1.9
AUFARBEITUNG
VON
RNA
.
69
6.2.1.10
RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.
70
6.2.1.11
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
FUER
RNA
.
70
6.2.1.12
NORTHERN-BLOT
.
70
6.2.1.13
HYBRIDISIERUNG
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
71
6.2.1.14
HERSTELLUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDEN
.
71
6.2.2
ZELLKULTUR
.
72
6.2.2.1
KULTUR
VON
CHO-ZELLEN
.
72
6.2.2.2
TRYPAN-BLAU-FAERBUNG
VON
CHO-ZELLEN
72
6.2.2.3
TRANSFEKTION
VON
PLASMID-DNA
IN
CHO-ZELLEN
.
73
6.2.2.4 SELEKTION
UND
KLONIERUNG
STABIL
TRANSFIZIERTER
CHO-ZELLEN
.
73
6.2.2.5
KONSERVIERUNG
STABIL
TRANSFIZIERTER
CHO-ZELLEN
.
74
6.2.3
PROTEINBIOCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
74
6.2.3.1
SOLUBILISIERUNG
VON
ZELLMATERIAL
.
74
6.2.3.2
PROTEINBESTIMMUNG
.
75
6.2.3.3
DPP
IV-ENZYMAKTIVITAETSBESTIMMUNG.
75
6.2.3.4
AZETONFAELLUNG
.
75
6.2.3.5
IMMUNPRAEZIPITATION
.
75
6.2.3.6
DISKONTINUIERLICHE
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
76
6.2.3.7
WESTERN-BLOT
UND
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
.
77
6.2.3.7.1
WESTEM-BLOT
.
77
6.2.3.7.2
PONCEAU-FAERBUNG
VON
BLOTMEMBRANEN
.
77
6.2.3.7.3
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
AUF
BLOTMEMBRANEN
NACH
DER
ECL
METHODE
(ENHANCED
CHEMOLUMINESCENCE)
.
77
6.2.3.8
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
78
6.2.3.9
IMMUNFLUORESZENZ
.
78
6.2.3.10
PULSE-CHASE-EXPERIMENTE
.
79
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
80-90
ANHANG:
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
.
91
LEBENSLAUF.
.
92
DANKSAGUNGEN.
93 |
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