Methodenentwicklung zum Nachweis gebundener Rückstände von Pflanzenschutzmitteln im Boden auf Basis der ELISA-Technik am Beispiel des Wirkstoffes Bentazon:
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Aachen
Shaker
2001
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Titel: Methodenentwicklung zum Nachweis gebundener Rückstände von Pflanzenschutzmitteln im Boden auf Basi
Autor: Harreus, Dirk
Jahr: 2001
Inhalt
EINLEITUNG
II THEMATISCHER HINTERGRUND . 3
1 Gebundene Rückstände 3
1.1 Detektionsmethoden 4
1.2 Ökologische und ökonomische Bedeutung 6
1.3 Rechtlicher Hintergrund 8
2 Der Wirkstoff Bentazon 10
III ZIELSETZUNG DER ARBEIT . 14
IV GRUNDLAGEN BEZÜGLICH METHODIK UND MATERIAL 15
1 Biochemische Methoden 15
1.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 15
1.1.1 Sandwich-EUSA 16
1.1.2 Kompetitiver ELISA 17
1.1.3 Dot-BIot-Assay 19
1.2 Proteinbestimmung nach Bradford (1976) 21
1.3 IgG-Isolierung 22
2 Chemische Methoden 23
2.1 N-Hydroxysuccinimid-Carbodiimid-Methode 23
3 Radiochemische Methoden 25
4 Physikalische Methoden 26
4.1 Bestimmung der Bodenfeuchte 26
4.2 Bestimmung der Maximalen Wasserkapazität 26
5 Bodenmikrobiologische Methoden 27
5.1 Bestimmung der mikrobiellen Biomasse 27
6 Herstellung der Antiseren 28
6.1 Kaninchen anti-Bentazon Ziege anti-Bentazon Antiserum 28
6.1.1 Immunisierungskonjugat 29
6.2 Kaninchen anti-Huminstoff Antiseren 29
6.2.1 Humin-bzw. Fulvinsäurefraktion 30
6.2.2 Immunisierungskonjugat 31
7 Mathematische Methoden 33
7.1 B/Bo (%)-Werte • 33
7.2 logit/log-Transformation (Hock 1995) 33
7.3 Berechnung der Kreuzreaktivität (KR) 34
7.4 Regressionsgerade zur Proteinbestimmung 35
7.5 Mann-Whitney-Wilcoxon-Test 36
8 Chemikalien Organische Verbindungen 37
9 Gebrauchslösungen 38
10 Antikörper Antiseren 40
11 Verbrauchsmaterial 41
12 Geräte 42
V ÜBERPRÜFUNG DER ANTISEREN . 43
1 Anti-Bentazon Antiseren 44
1.1 Allgemeines Protokoll des kompetitiven ELISA 44
1.2 Kaninchen anti-Bentazon Antiserum 45
1.2.1 Entwicklungsverlauf 45
1.2.2 Ergebnisse 46
1.2.3 Nachweisgrenze 50
1.3 Ziege anti-Bentazon Antiserum 52
1.3.1 Entwicklungsverlauf 52
1.3.2 Ergebnisse 53
1.3.3 Nachweisgrenze 56
2 Anti-Huminstoff Antiseren 58
2.1 Light Absorbance Dot Immuno Enzymatical System (LADIES) 59
2.1.1 Allgemeines Protokoll 61
2.1.2 Entwicklungsverlauf Ergebnisse 62
2.1.3 Schlußfolgerung 71
2.2 Kompetitiver ELISA mit unkonjugierten Huminstoffen 72
2.2.1 Entwicklungsverlauf 72
2.2.2 Ergebnis 73
2.2.3 Schlußfolgerung 74
2.3 Kompetitiver ELISA mit kovalent gebundenen Huminstoffen 76
2.3.1 Allgemeines Protokoll 78
2.3.2 Huminsäuren 79
2.3.2.1 Entwicklungsverlauf Ergebnisse 79
2.3.2.2 Nachweisgrenzen 93
2.3.3 Fulvinsäuren 94
2.3.3.1 Entwicklungsverlauf Ergebnisse 94
2.3.3.2 Schlußfolgerung 99
3 Kreuzreaktivitäten 100
3.1 Kaninchen anti-Bentazon Antiserum Huminsäuren 100
3.2 Ziege anti-Bentazon Antiserum Huminsäuren 103
VI ENTWICKLUNG DES SANDjnCH-EUSA AUF DYNABEADS 107
1 Dynabeads mit Sekundärantikörpern 114
1.1 Allgemeines Protokoll 115
1.2 Sandwich-ELISA mit dem Kaninchen anti-Bentazon Antiserum 117
1.2.1 Entwicklungsverlauf Ergebnisse 117
1.3 Sandwich-ELISA mit dem Ziege anti-Bentazon Antiserum 126
1.3.1 Entwicklungsverlauf Ergebnisse 126
1.4 Schlußfolgerung 129
2 Tosylaktivierte Dynabeads 131
2.1 Allgemeines Protokoll 133
2.2 Äm/w/c/i-ELISA mit dem Ziege anti-Bentazon Antiserum 134
2.2.1 Entwicklungsverlauf Ergebnisse 134
2.3 Schlußfolgerung 137
VII REFERENZSUBSTANZ GEBUNDENE RÜCKSTÄNDE 138
1 Referenzsubstanz 13S
1.1 Entwicklung der Laccase-Methode 141
1.2 Darstellung der Referenzsubstanz 145
2 Gebundene Rückstände 146
2.1 Versuchsboden 146
2.2 Inkubationsgefäße 147
2.3 Wirkstoffapplikation 149
2.4 Probenahme und Aufarbeitung 149
2.4.1 CO2-Fallen 149
2.4.2 Bodenproben 150
2.5 Darstellung des Probenpools 152
VIII ANWENDUNG DES SANDWICH-EIASA . 157
1 Sanrfiv/c/»-ELISA Referenzsubstanz 157
1.1 Versuchsverlauf Ergebnisse 157
1.2 Schlußfolgerung 177
2 Sandwich-EUSA gebundene Rückstände 178
2.1 Versuchsverlauf Ergebnisse 179
2.2 Schlußfolgerung 180
IX DISKUSSION . 182
1 Referenzsubstanz Sandwich-ELISA 183
2 Gebundene Rückstände Sandwich-EUSA 184
3 Bewertung des Sandwich-EUSA 187
X ZUSAMMENFASSUNG . 191
XI LITERATUR . 192 |
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