Rearrangierungen des RET-Proto-Onkogens und ihre Bedeutung für die Entstehung strahleninduzierter Schilddrüsentumoren bei Kindern und Erwachsenen nach dem Reaktorunfall von Tschernobyl:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
VIII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
X
ABKUERZUNGEN
XII
A.
EINLEITUNG
1
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
6
1
UNTERSUCHTE
GEWEBE
UND
GEWEBEASSERVIERUNG
6
1.1
UNTERSUCHTE
SCHILDDRUESENGEWEBEPROBEN
6
1.1.1
WEISSRUSSISCHE
SCHILDDRUESENTUMOREN
6
1.1.2
REFERENZKOLLEKTIV
VON
SCHILDDRUESENTUMOREN
6
1.2
GEWEBEASSERVIERUNG
6
1.3
HISTOPATHOLOGISCHE
BEFUNDUNG
DER
SCHILDDRUESENGEWEBEPROBEN
7
2
GEWEBEKULTIVIERUNG
10
2.1
VERWENDETE
NAEHRMEDIEN,
PUFFER
UND
ZUSAETZE
10
2.1.1
NAEHRMEDIEN
10
2.1.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
10
2.1.3
ZUSAETZE
11
2.2
ETABLIERUNG
PRIMAERER
ZELLKULTUREN
AUS
SCHILDDRUESENGEWEBEPROBEN12
2.2.1
ETABLIERUNG
VON
PRIMAERKULTUREN
12
2.2.2
WEITERKULTIVIERUNG
DER
PRIMAERKULTUREN
12
2.2.2.1
MEDIUMWECHSEL
13
2.2.2.2
PASSAGE
DER
PRIMAERKULTUREN
13
2.3
KONSERVIERUNG
DER
PRIMAEREN
ZELLKULTUREN
13
INHALTSVERZEICHNIS
3
HERSTELLUNG
ZYTOGENETISCHER
PRAEPARATE
AUS
PRIMAEREN
SCHILDDRUESEN-ZELLKULTUREN
14
3.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
14
3.1.2
DURCHFUEHRUNG
DER
PRAEPARATION
14
4
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
15
4.1
VERWENDETE
KLONE
ZUR
HERSTELLUNG
VON
DNA-SONDEN
15
4.2
KULTIVIERUNG
VON
BAKTERIEN
17
4.2.1
NAEHRMEDIEN
UND
ZUSAETZE
17
4.2.2
KULTURBEDINGUNGEN
17
4.3
KULTIVIERUNG
VON
YACS
(YYYEAST
ARTIFICIAL
CHROMOSOMES
"
)
18
4.3.1
NAEHRMEDIEN
UND
ZUSAETZE
18
4.3.2
KULTURBEDINGUNGEN
19
4.4
METHODEN
ZUR
DNA-ISOLIERUNG
19
4.4.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
19
4.4.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
UZ-MASSSTAB
19
4.4.1.1.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
19
4.4.1.1.2
DURCHFUEHRUNG
DER
PLASMID-DNA
ISOLIERUNG
21
4.4.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
MITTELS
PLASMIDSCHNELLISOLIERUNGS-KIT22
4.4.1.2.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
22
4.4.1.2.2
DURCHFUEHRUNG
DER
PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG
23
4.4.2
ISOLIERUNG
VON
YAC-DNA
23
4.4.2.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
23
4.4.2.2
DURCHFUEHRUNG
DER
YAC-DNA-ISOLIERUNG
24
4.4.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
DER
PAPILLAEREN
SCHILDDRUESEN
KARZINOM-ZELLINIE
TPC1
26
4.4.3.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
26
4.4.3.2
DURCHFUEHRUNG
DER
DNA-ISOLIERUNG
27
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.4
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
PERIPHEREM
BLUT
28
4.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
29
4.5.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
VON
DNA
29
4.5.2
FLUOROMETRISCHE
BESTIMMUNG
VON
DNA
29
4.6
RESTRIKTION
VON
DNA
30
4.7
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
30
4.7.1
HORIZONTALE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
31
4.7.1.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
31
4.7.1.2
DURCHFUEHRUNG
DER
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
32
4.7.2
GROESSENBESTIMMUNG
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
32
4.7.3
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
33
4.8
IMMOBILISIERUNG
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
MITTELS
DOT
BLOT
34
4.8.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
34
4.8.2
DURCHFUEHRUNG
35
4.9
NICHTRADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
FUER
DEN
EINSATZ
IN
FISH-EXPERIMENTEN
35
4.9.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
35
4.9.2
NICK
TRANSLATION
37
4.9.2.1
MARKIERUNG
VON
PLASMID-UND
YAC-DNA
MITTELS
NICK
TRANSLATION
37
4.9.2.2
MARKIERUNG
VON
GESAMTGENOMISCHER
DNA
MITTELS
NICK
TRANSLATION38
4.9.3
OLIGOMARKIERUNG
(YYRANDOM-PRIMED
LABELLING
"
)
39
4.9.3.1
MARKIERUNG
VON
P1-DNA
MITTELS
OLIGOMARKIERUNG
39
4.9.4
REINIGUNG
DES
MARKIERUNGSANSATZES
MITTELS
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
40
4.9.5
AUFKONZENTRIERUNG
VON
DNA
DURCH
ETHANOLFAELLUNG
40
4.10
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
41
INHALTSVERZEICHNIS
4.11
FLUORESZENZ
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
(FISH)
41
4.11.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
41
4.11.2
FISH
AN
KULTIVIERTEN
SCHILDDRUESENZELLEN
44
4.11.2.1
VORBEREITUNG
UND
DENATURIERUNG
DER
VERSCHIEDENEN
DNA-SONDEN
44
4.11.2.2
DENATURIERUNG
DER
ZELLPRAEPARATIONEN
46
4.11.2.3
WASCHEN
DER
OBJEKTTRAEGER
46
4.11.2.4
DETEKTION
DER
MARKIERTEN
DNA-ABSCHNITTE
MIT
FLUORESZENZFARBSTOFFEN
47
4.11.2.5
MIKROSKOPISCHE
BEURTEILUNG
49
4.11.3
YYCOMPARATIVE
GENOMIC
HYBRIDISATION
"
(CGH)
49
4.11.3.1
VORBEREITUNG
UND
DENATURIERUNG
DER
REFERENZ
UND
TUMOR-DNA
SONDEN
50
4.11.3.2
DENATURIERUNG
DER
METAPHASEPRAEPARATE
50
4.11.3.3
WASCHEN
DER
OBJEKTTRAEGER
50
4.11.3.4
DETEKTION
DER
REFERENZ
UND
TUMOR-DNA
50
4.11.4
YYSPECTRAL
KARYOTYPING
"
(SKY)
51
4.11.4.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
51
4.11.4.2
DURCHFUEHRUNG
DER
SKY-HYBRIDISIERUNG
53
4.12
ISOLIERUNG
VON
MRNA
AUS
SCHILDDRUESENGEWEBE
55
4.12.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
55
4.12.2
DURCHFUEHRUNG
DER
MRNA-LSOLIERUNG
56
4.13
CDNA-HERSTELLUNG
58
4.13.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
58
4.13.2
DURCHFUEHRUNG
DER
CDNA-HERSTELLUNG
59
4.14
POLYMERASEKETTENREAKTION
59
4.14.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
60
INHALTSVERZEICHNIS
4.14.2
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR-REAKTIONEN
64
4.14.2.1
AMPLIFIKATION
GESAMTGENOMISCHER
YAC-DNA
MITTELS
PCR
64
4.14.2.2
AMPLIFIKATION
VERSCHIEDENER
REARRANGIERUNGSVARIANTEN
DES
RET-PROTO-ONKOGENS
MITTELS
RT-PCR
64
4.14.2.3
AMPLIFIKATION
VON
SEQUENZEN
AUS
DER
KATALYTISCHEN
DOMAENE
VON
TYROSINKINASE-GENEN
65
4.14.2.4
GROESSENSELEKTION
MITTELS
PCR
66
4.14.2.5
MULTIPLEX-PCR
ZUR
ERMITTLUNG
VON
SCHILDDRUESENTUMOREN
MIT
UNBEKANNTEN
RET-REARRANGIERUNGEN
67
4.14.2.5.1
AUSWERTUNG
DER
MULTIPLEX-RT-PCR
MIT
HILFE
DES
A.L.F.
DNA
SEQUENCER
68
4.14.2.6
5
-RACE
(YYRAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
"
)
70
4.14.2.6.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
70
4.14.2.6.2
DURCHFUEHRUNG
DER
5'-RACE-PCR
71
4.15
KLONIERUNG
VON
EXPRIMIERTEN
TYROSINKINASE-GENEN
74
4.15.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
74
4.15.2
KLONIERUNGSSTRATEGIE
75
4.16
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
VON
NYLONMEMBRANEN
77
4.16.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
TI
4.16.2
DURCHFUEHRUNG
DER
RADIOAKTIVEN
HYBRIDISIERUNG
78
4.16.3
AUTORADIOGRAPHIE
79
4.16.4
REHYBRIDISIERUNG
VON
ZETA-PROBE
MEMBRANFIITEM
79
4.17
SEQUENZIERUNG
80
4.17.1
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
80
4.17.1
DURCHFUEHRUNG
81
5
STATISTISCHE
METHODEN
81
INHALTSVERZEICHNIS
C.
ERBEBNISSE
82
1
RT-PCR
UNTERSUCHUNGEN
DER
RET-PROTO-ONKOGENS
82
1.1
RT-PCR
UNTERSUCHUNGEN
AN
PAPILLAEREN
SCHILDDRUESENKARZINOMEN
MITTELS
RET-REARRANGIERUNGS-SPEZIFISCHER
PRIMER
82
1.2
MULTIPLEX-PCR
88
1.2.1
VALIDIERUNG
DER
MULTIPLEX-PCR
90
1.2.2
DETEKTION
VON
FAELLEN
MIT
RET-REARRANGIERUNGEN
MITTELS
MULTIPLEX-PCR
90
2
NEUE
AKTIVIERUNGSFORMEN
DES
RET-PROTO-ONKOGENS
92
2.1
DER
FALL
S224T
92
2.2
DER
FALL
S271T
94
3
UNTERSUCHUNGEN
DES
RET-PROTO-ONKOGENS
MITTELS
FLUORESZENZ-IN
SFTU-HYBRIDISIERUNG
96
3.1
VALIDIERUNG
DER
VERWENDETEN
YAC-SONDENKOMBINATION
97
3.2
DETEKTION
RET-SPEZIFISCHER
STRUKTURELLER
REARRANGIERUNGEN
MITTELS
FISH
102
3.2.1
KARTIERUNG
DES
AN
DER
RET/PTC7
ONKOGENEN
REARRANGIERUNG
BETEILIGTEN
RFG7-GENS
106
4
MOLEKULARZYTOGENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
PAPILLAEREN
SCHILDDRUESENKARZINOM-ZELLINIE
TPC1
111
4.1
SPEKTRALE
KARYOTYPISIERUNG
(SKY)
DER
TPC
1
-ZELLINIE
111
4.2
FISH-ANALYSE
DER
TPC-ZELLINIE
MITTELS
RET-LOKUS-SPEZIFISCHER
DNA-SONDEN
112
4.3
CGH-ANALYSE
DER
TPC1-ZELLINIE
115
5
MOLEKULARZYTOGENETISCHE
ANALYSE
KINDLICHER
PAPILLAERER
SCHILDDRUESENKARZINOME
MITTELS
WCP
SONDEN
UND
SPEKTRALER
KARYOTYPISIERUNG
(SKY)
117
INHALTSVERZEICHNIS
5.1
FISH-ANALYSE
STRUKTURELLER
CHROMOSOMENVERAENDERUNGEN
MITTELS
WCP-SONDEN
FUER
CHROMOSOMEN
1,4,6,
7,9,12
117
5.2
SKY-ANALYSE
STRUKTURELLER
CHROMOSOMENVERAENDERUNGEN
119
6
KLONIERUNG
EXPRIMIERTER
TYROSINKINASE-GENE
MITTELS
DEGENERIERTER
PRIMER
121
D.
DISKUSSION
124
1
MOLEKULARGENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
SCHILDDRUESENTUMOREN
124
1.1
RT-PCR
UNTERSUCHUNGEN
DES
RET-PROTO-ONKOGENS
124
1.2
NEUE
AKTIVIERUNGSFORMEN
DES
RET-PROTO-ONKOGENS
129
2
MOLEKULARZYTOGENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
SCHILDDRUESENTUMOREN
134
2.1
DETEKTION
VON
RET-REARRANGIERUNGEN
MITTELS
YAC-DNA-SONDEN
134
2.2
KARTIERUNG
DES
RFG7-GENS
137
2.3
FISH-ANALYSEN
KINDLICHER
PAPILLAERER
SCHILDDRUESENKARZINOME
MITTELS
WCP-SONDEN
137
2.4
SPEKTRALE
KARYOTYPISIERUNG
(SKY)
139
2.5
MOLEKULARZYTOGENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TPC1-ZELLINIE
139
3
KLONIERUNG
VON
PROTEIN-TYROSINKINASE-GENEN
140
E.
ZUSAMMENFASSUNG
142
F.
ANHANG
145
1
BEZUGSQUELLEN
145
2
KLONIERTE
SEQUENZEN
VON
TYROSINKINASEN
147
G.
LITERATURVERZEICHNIS
152 |
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