Untersuchungen zur Funktionsweise der molekularen Chaperone GroEL und GroES aus E. coli:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
PROTEINE
1
1.2
MOLEKULARE
CHAPERONE
2
1.3
DAS
CHAPERONIN
GROEL
UND
SEIN
CO-CHAPERONIN
GROES
5
1.4
DIE
STRUKTUR
DES
CHAPERONINS
GROEL
5
1.5
DIE
STRUKTUR
DES
CO-CHAPERONINS
GROES
8
1.6
DIE
STRUKTUR
DES
GROEL/GROES-KOMPLEXES
9
1.7
MODELLE
DER
CHAPERONIN-UNTERSTUETZTEN
RUECKFALTUNG
11
2
FRAGESTELLUNG
17
3
ERGEBNISSE
19
3.1
ISOLIERUNG
DER
CHAPERONINE
GROEL
UND
GROES
AUS
E.
COLI
19
3.2
UNTERSUCHUNGEN
AM
CHAPERONIN
GROEL
23
3.2.1
UNTERSUCHUNG
DER
ATPASE-AKTIVITAET
VON
GROEL
23
3.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
GROEL-UNTERSTUETZTEN
RUECKFALTUNG
24
3.2.2.1
RUECKFALTUNG
UNTER
YYPERMISSIVE
CONDITIONS
"
24
3.2.2.2
RUECKFALTUNG
UNTER
YYNON-PERMISSIVE
CONDITIONS
"
25
3.2.3
INAKTIVIERUNG
VON
GROEL
MIT
CR-ATP
29
3.2.3.1
EINFLUSS
DER
INAKTIVIERUNG
AUF
DIE
ATPASE-AKTIVITAET
30
3.2.3.2
EINFLUSS
DER
INAKTIVIERUNG
AUF
DIE
RUECKFALTUNGSAKTIVITAET
33
3.2.3.3
DISKUSSION
DER
INAKTIVIERUNGSEXPERIMENTE
35
3.3
UNTERSUCHUNG
DES
GROEL/GROES-SYSTEMS
43
3.3.1
UNTERSUCHUNG
DER
ATPASE-AKTIVITAET
DES
GROEL/GROES-SYSTEMS
43
3.3.2
TITRATION
DER
ZUGAENGLICHEN
NUCLEOTIDBINDUNGSSTELLEN
IM
GROEL/
GROES-SYSTEM
45
3.3.3 UNTERSUCHUNG
DER
GROEL/GROES-UNTERSTUETZTEN
RUECKFALTUNG
49
3.3.3.1
RUECKFALTUNG
UNTER
YYPERMISSIVE
CONDITIONS
"
49
3.3.3.2
RUECKFALTUNG
UNTER
YYNON-PERMISSIVE
CONDITIONS
"
51
3.3.4
INAKTIVIERUNG
DES
GROEL/GROES-SYSTEMS
MIT
CR-ATP
52
3.3.4.1
EINFLUSS
DER
INAKTIVIERUNG
AUF
DIE
ATPASE-AKTIVITAET
52
3.3.4.2
EINFLUSS
DER
INAKTIVIERUNG
AUF
DIE
RUECKFALTUNGSAKTIVITAET
54
3.3.4.3
BESTIMMUNG
DER
ZUGAENGLICHEN
NUCLEOTIDBINDUNGSSTELLEN
NACH
IN
AKTIVIERUNG
58
3.3.4.4
DISKUSSION
DER
INAKTIVIERUNGSEXPERIMENTE
59
4
ZUSAMMENFASSUNG
65
5
EXPERIMENTELLER
TEIL
71
5.1
ALLGEMEINES
71
5.1.1
ULTRAVIOLETTSPEKTROSKOPIE
(UV-SPEKTROSKOPIE)
71
5.1.2
ELEKTRONENSPINRESONANZ-SPEKTROSKOPIE
(ESR-SPEKTROSKOPIE)
71
5.1.3
ZENTRIFUGATION
71
5.2
ALLGEMEINE
ARBEITSMETHODEN
72
5.2.1
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTES
NACH
BRADFORD
(1976)
72
5.2.1.1
REAGENZIEN
72
5.2.1.2 STANDARDLOESUNG
FUER
PROTEINBESTIMMUNGEN
72
5.2.1.3
DURCHFUEHRUNG
DER
BESTIMMUNG
73
5.2.4.1
ERSTELLUNG
DES
BRADFORDPROFILS
73
5.2.2
BESTIMMUNG
DER
NUCLEOTIDKONZENTRATION
74
5.2.3 GELZENTRIFUGATION
NACH
PENEFSKY
(1977)
74
5.2.4
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
75
5.2.4.1
REAGENZIEN
75
5.2.4.2
DURCHFUEHRUNG
76
5.3
ISOLIERUNG
DER
CHAPERONE
GROEL
UND
GROES
77
5.3.1
REAGENZIEN
UND
KULTURMEDIEN
77
5.3.2
ANLEGEN
DER
GLYCERINKULTUREN
78
5.3.3
KULTIVIERUNG
DES
E.
COLI
STAMMES
DH5A
MIT
DEM
PLASMID
PGROESL
79
5.3.4
AUFSCHLUSS
DER
E.
COLI
ZELLEN
MIT
ENZYMATISCHER
LYSE
80
5.3.4.1
REAGENZIEN
80
5.3.4.2
DURCHFUEHRUNG
80
5.3.5
AUFSCHLUSS
DER
E.
COLI
ZELLEN
MITTELS
EMULSIFLEX-HOMOGENIZER
81
5.3.5.1
REAGENZIEN
81
5.2.5.2
DURCHFUEHRUNG
81
5.3.6
REINIGUNG
DER
ROHPROTEINLOESUNG
82
5.3.6.1
REAGENZIEN
82
5.3.6.2
DURCHFUEHRUNG
82
5.4
COUPLED
ENZYME
ASSAY
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ATPASE-AKTIVITAET
84
5.4.1
REAGENZIEN
84
5.4.2
MESSUNG
DER
ATPASE-AKTIVITAET
85
5.4.3
UNTERSUCHTE
PROTEINLOESUNGEN
85
5.4.3.1
GROEL
85
5.4.3.2
GROEL/GROES-KOMPLEX
85
5.4.3.3
GROEL
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
86
5.4.3.4
GROEL/GROES-KOMPLEX
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
86
5.5
RUECKFALTUNGSASSAYS
UNTER
YYPERMISSIVE
CONDITIONS
"
87
5.5.1
REAGENZIEN
87
5.5.2
MESSUNG
DER
LDH-RUECKFALTUNG
88
5.5.3
CHAPERONIN-UNTERSTUETZTE
LDH-RUECKFALTUNG
89
5.5.3.1
GROEL
89
5.5.3.2
GROEL
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
89
5.5.3.3
GROEL/GROES-KOMPLEX
89
5.OE.3.4
GROEL/GROES-KOMPLEX
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
90
5.6.
RUECKFALTUNGSASSAYS
UNTER
YYNON-PERMISSIVE
CONDITIONS
"
91
5.6.1
REAGENZIEN
91
5.6.2
MESSUNG
DER
MDH-RUECKFALTUNG
92
5.6.3
CHAPERONIN-UNTERSTUETZTE
MDH-RUECKFALTUNG
93
5.6.3.1
GROEL
93
5.6.3.2
GROEL
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
93
5.6.3.3
GROEL/GROES-KOMPLEX
93
5.6.3.4
GROEL/GROES-KOMPLEX
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
94
5.7
BINDUNGSSTELLENTITRATIONEN
95
5.7.1
REAGENZIEN
95
5.7.2
BESTIMMUNG
DER
ZUGAENGLICHEN
NUCLEOTIDBINDUNGSSTELLEN
VON
GROEL
95
5.7.3
BESTIMMUNG
DER
ZUGAENGLICHEN
NUCLEOTIDBINDUNGSSTELLEN
IM
96
GROEL/GROES-KOMPLEX
5.7.4
ZUGAENGLICHE
NUCLEOTIDBINDUNGSSTELLEN
IM
GROEL/GROES-KOMPLEX
NACH
INAKTIVIERUNG
MIT
CR-ATP
97
5.8
SYNTHESE
VON
CR-ATP
98
6
LITERATUR
100
7
ANHANG
105
7.1
ABKUERZUNGEN
105
7.2
MATERIALIEN
107
7.3
ROHDATEN
109
7.4
KURVENFITTINGS
121 |
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