Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella-Mip-Proteins:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1. ZUSAMMENFASSUNG.1
1.1 SUMMARY.4
2. EINLEITUNG.6
2.1
LEGIONELLA PNEUMOPHILA - UMWELTKEIM UND PATHOGENES AGENS.6
2.2 INTRAZELLULAERE VERMEHRUNG VON LEGIONELLEN IN PROFESSIONELLEN
PHAGOZYTEN.7
2.3 INTRAZELLULAERE VERMEHRUNG VON LEGIONELLEN IN PROTOZOEN.9
2.4 VIRULENZFAKTOREN VON LEGIONELLEN. 11
2.5 DIE ROLLE VON EISEN IN DER INTRAZELLULAEREN Z,G/CWM^-INFEKTION.16
2.6 DAS LEGIONELLA MIP-PROTEIN - VIRULENZFAKTOR UND IMMUNOPHILIN.17
2.6.1 DAS LEGIONELLA MIP-PROTEIN IST EINE PPIASE
.17
2.6.2 PPIASEN - EINTEILUNG UND IN VIVO-FUNKTIONEN. 17
2.6.3 STRUKTURELLE UNDFUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG MIP-VERWANDTER
PROTEINE.20
2.7 GFP, EIN NEUER REPORTER FUER INTRAZELLULAERE PATHOGENE.23
2.8 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.24
3. MATERIAL UND METHODEN.25
3.1 GERAETE.25
3.2 BAKTERIENSTAEMME:.26
3.3 VEKTOREN.27
3.3.1 REKOMBINANTE PLASMIDE.28
3.4 CHEMIKALIEN.29
3.4.1 ANTIKOERPER.29
3.4.2 GROESSENMARKER.30
3.4.3 OLIGONUKLEOTIDE.30
3.5 MEDIEN.32
3.5.1 LB-MEDIUM FUER DIE ANZUCHT VON E. COLI.32
3.5.2 A(C)IX-MEDIUM.32
3.5.3 ANTIBIOTIKA.33
3.5.4 MEDIEN FUER DIE ANZUCHT VON LEGIONELLA.33
3.5.5 ACES-YEAST-EXTRACT (AYE)-FLUESSIGMEDIUM (PH6.9).33
3.5.6 BUFFERED-CHAROCAL-YEAST-EXTRACT'(BCYE) (PH 6.9)-AGARPLATTEN.33
3.5.7 ZELLKULTURMEDIEN.34
3.5.7.1 PYG-712 MEDIUM FUER ACANTHAMOEBA CASTELLANII.34
3.5.7.2PYNFHMEDIUM (ATCC#1034)SSR HARTMANNELIA VERMIFORMIS.34
3.6 INFEKTION VON A. CASTELLANII UND//, VERMIFORMIS.35
3.6.2 INVASIONSASSAY, QUANTIFIZIERUNG DURCH CFU-BESTIMMUNG.36
3.6.3 INVASIONSASSAY, QUANTIFIZIERUNG DURCH FACS-ANALYSE./.36
3.6.4 INVASIONASSAY IN GEGENWART VON PHAGOZYTOSE-INHIBITOREN.37
3.7 DNA-TECHNIKEN. 37
3.7.1 MINI-PLASMIDPRAEPARATION. 37
3.7.2 PLASMIDPRAEPARATION MIT QIAGEN-SAEULEN
.38
3.7.3 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA (GROSSER MASSSTAB).39
3.7.4 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION.40
3.7.5 ETHANOLFAELLUNG VON DNA. 40
3.7.6 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION UND DES REINHEITSGEHALTS
.41
3.7.7 BEHANDLUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.41
3.7.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.41
3.7.9 ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE-GELEN MIT DEM
GENE-CLEAN-KIT.42
3.7.10 ANKONZENTRIERUNG UND REINIGUNG VON DNA MIT DEM GENE-CLEAN-KIT.43
3.7.11 BEHANDLUNG VON INSERT-DNA MIT DEM KLENOW-ENZYM
.43
3.7.12 BEHANDLUNG VON DNA MIT DER T4-POLYMERASE.44
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS_
II
3.7.13 ALKALISCHE PHOSPHATASE-BEHANDLUNG.44
3.7.14 LIGATION VON VEKTOR- UND INSERT-DNA.45
3.7.15 KLONIERUNGS-KITS.45
3.7.16 PCR REAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION).46
3.7.17 "SITE-SPEZIFISCHE " MUTAGENESE MITTELS PCR.47
3.7.18 DNA-SEQUENZIERUNG MIT FLUORESZENZMARKIERTEN PRIMERN.48
3.8 TRANSFORMATION.49
3.8.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI
.49
3.8.2 HEAT-SHOCK-TRANSFORMATION VON E. COLI.49
3.8.3 ELEKTROPORATION VON L. PNEUMOPHILA.50
3.9 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.*.51
3.9.1 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG MITTELS SDS-PAGE.51
3.9.2 COOMASSIE-FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN.52
3.9.3 SILBERFOERBUNG
.52
3.9.4 PROTEIN-TRANSFER AUF NITROZELLULOSEMEMBRAN (WESTERNBLOT).53
3.9.5 TRANSFER VON GESAMTZELLPROTEINEN AUF NITROZELLULOSE
(IMMUNOKOLONIEBLOT).54
3.9.6 DETEKTION DER ANTIGEN-ANTIKOERPER REAKTION.54
3.9.7 STRIPPING VON BLOTMEMBRANEN.55
3.9.8 ANZUCHT VON E. COLI UND DIE INDUKTION DER PROTEINBIOSYNTHESE.55
3.9.9 FRENCH-PRESS, MECHANISCHE LYSE. 56
3.9.10 TCA-FAELLUNG.:.56
3.9.11 PROTEINAUFREINIGUNG VON MIP.56
3.9.12 PERIPLASMA-PRAEPARATION VON E. COLI UND LEGIONELIA.57
3.9.13 CHEMISCHE QUERVERNETZUNG VON PROTEINEN (CROSS-LINKING).57
3.9.14 PROTEIN-ANREICHERUNG MITTELS IMMUNPRAEZIPITATION.58
3.9.15 PROTEINREINIGUNG MITTELS UMKEHRPHASEN-HPLC UNDN-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
.59
3.9.16 BESTIMMUNG DER MOLEKULAREN MASSE.59
3.10 SOUTHERNBLOT.60
3.10.1 SONDENMARKIERUNG (AMERSHAM).61
3.10.2 DNA-HYBRIDISIERUNG
.61
3.10.3 CHEMILUMINESZENZ-(ECL)-ENTWICKLUNG.62
3.11 FLUORESZENZ GESTUETZE METHODEN.62
3.11.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE.62
3.11.2 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS-ANALYSE)
.63
3.11.3 BESTIMMUNG DER FLUORESZENZINTENSITAETEN (SPEKTROFLUORIMETRIE).63
3.12 L.
PNEUMOPHILA
INFEKTION IM TLERMODELL.64
4. ERGEBNISSE.
65
4.1 ENTWICKLUNG DES GFP-REPORTERSYSTEMS IN LEGIONELLA.
65
4.1.1 KONSTRUKION DER GFP-EXPRESSIONSVEKTOREN.I.65
4.1.2 ANALYSE DER MIP- UND SOD-PROMOTERAKTIVITAETEN IN L. PNEUMOPHILA
DURCH GFP-VERMITTELTE
FLUORESZENZ.66
4.1.3 FACS-ANALYSE DER GFP-EXPRIMIERENDEN LEGIONELLA-STAEMME.68
4.1.4 IN VITRO ANALYSE DER MIP- UND SOD-PROMOTERAKTIVITAETEN
.69
4.1.5 IN VIVO-MONITORING EINER LEGIONELLA-INFEKTION IN ACANTHAMOEBA
CASTELLANII.71
4.1.6 QUANTIFIZIERUNG DES INTRAZELLULAEREN WACHSTUMS MITTELS
FACS-ANALYSE.72
4.1.7 FACS-ANALYSE DER INVASION UND INTRAZELLULAERER
WACHSTUMSCHARAKTERISTIKA VERSCHIEDENER
GFP-EXPRIMIERENDER LEGIONELLA-STAEMME
.73
4.1.8 EINFLUSS VON INHIBITOREN AUF DIE PHAGOZYTOSE BEI H. VERMIFORMIS
UND A. CASTELLANII.75
4.1.9 ZUSAMMENFASSUNG.^
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.2 KONSTRUKTION VON MIP::GFP-FUSIONSPROTEINEN.82
4.2.1 KLONIERUNG DER KONSTRUKTE.82
4.2.2 WESTEMBLOT-ANALYSE DER MIP::GFP- FUSIONSPROTEINE.83
4.2.3 FLUORESZENZMIKROSPOPISCHE ANALYSE VON L. PNEUMOPHILA
JR32-2(PRK78).84
4.2.4 ANALYSE DER MIPR.GFP-FUSIONSPROTEIN-PROZESSIERUNG IN E. COLI UNDL.
PNEUMOPHILA.85
4.2.5 ZUSAMMENFASSUNG.88
4.3 KONSTRUKTION EINES N-TERMINAL VERKUERZTEN MIP-PROTEINS.88
4.3.1 INTEGRATION DES N-TERMINAL VERKUERZTEN LEGIONELLA MIP L.P.FKBP(.
2
Q
3
, SO
2
I
3
IN DAS CHROMOSOM
DER MIP NEGATIVEN MUTANTE L.P. JR32-2.89
4.3.2 WESTERNBLOT-ANALYSE DER EXPRESSION VON L.P. FKBP25(2O-3: SO-M) IN
L. PNEUMOPHILA JR32-2.490
4.3.3 SOUTHERNBLOT-ANALYSE DER CHROMOSOMALEN INTEGRATION IN L.P.
JR32-2.4.91
4.3.4 INTRAZELLULAERE VERMEHRUNG VON L. PNEUMOPHILA JR32-2.4 IN A.
CASTELLANII.92
4.3.5 ZUSAMMENFASSUNG.94
4.4 SITE-SPEZIFISCHE MUTAGENESE DER N-TERMINALEN MLP-DOMAENE.94
4.4.1 AUSWAHL UND KONSTRUKTION DER MIP-PROTEINVARIANTEN
.94
4.4.2 SEQUENZANALYSE DER VERAENDERTEN MIP-PROTEINE.95
4.4.3 REINIGUNG UND STABILITAET DER PROTEINVARIANTEN.97
4.4.4 ANALYSE DES OLIGOMEREN ZUSTANDES DER PROTEINVARIANTEN.100
4.4.5 ZUSAMMENFASSUNG.102
4.5. VERSUCHE ZUR IDENTIFIZIERUNG EINES BAKTERIELLEN
INTERAKTIONSPARTNER.102
4.5.1 CHEMISCHE QUERVERNETZUNG DER LEGIONELLA-OBERFLAECHE
.103
4.5.2 IMMUNPRAEZIPITATION, AUSWAHL DER ANTIKOERPER.104
4.5.3 IMMUNPRAEZIPITATION, ANREICHERUNG DES IMMUNKOMPLEXES
.105
4.5.4 ZUSAMMENFASSUNG.107
4.6. DER EINFLUSS DER ISOMERASEAKTIVITAET IM TIERMODELL
(MEERSCHWEINCHEN).107
5. DISKUSSION.HO
5.1
GFP, EIN NEUER REPORTER IN LEGIONELLA.110
5.2 MIP::GFP-FUSIONSPROTEINE.117
5.3 STRUKTURELLE UND FUNKTIONALE CHARAKTERISTIKA DES LEGIONELLA
MIP-PROTEINS.118
5.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR DIMERISIERUNG DES MIP-PROTEINS MITTELS
SITE-SPEZIFISCHER
MUTAGENESE.125
5.5 DETEKTION EINES PUTATIVEN INTERAKTIONSPARTNERS.128
6. LITERATURVERZEICHNIS.130
7. ANHANG.1 7
7.1 ABKUERZUNGEN. I
47
7.2 SEQUENZ DES M/P-GENS.148
7.3 PUBLIKATIONEN.149
7.4 TAGUNGSBEITRAEGE.I49
7.5 LEBENSLAUF.151 |
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| topic_facet | Legionella pneumophila Grün fluoreszierendes Protein In vivo Bakterielle Infektion Hochschulschrift |
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