Untersuchungen über Expression und Regulation der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) in Skelettmuskelzellen in vitro:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
0 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL 7
2.1 VERSUCHSTIERE 7
2.2 ZELLKULTUR 7
2.2.1 ZELLINIEN 7
2.2.2 NAEHRMEDIEN, MEDIENZUSAETZE UND SEREN 7
2.2.2.1 SEREN 8
2.2.2.2 C2C12-ZELLEN 8
22.2.3 L8-ZELLEN 9
2.2.1.4 LOESUNGEN UND CHEMIKALIEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER ZELLINIEN 9
2.2.1.5 ZYTOKINE UND LPS FUER DIE ZELLSTIMULIERUNG 9
2.2.3 LOESUNGEN UND PUFFER FUER DIE ZELLKULTUR 9
2.3 CHEMIKALIEN, LOESUNGEN UND PUFFER FUER DIE ENZYMHISTOCHEMIE 10
2.4. INHIBITOREN UND DONATOREN DER NO-SYNTHASE ~ 10
2.4.1 INHIBITOREN 10
2.4.1.1 NADPH-UND FLAVIN-ANTAGONISTEN 10
2.4.1.1.1 DIPHENYLENIODIUMCHLORID (DPI) 11
2.4.1.2 HAEM-BINDENE HETEROZYKLISCHE NITROGEN-VERBINDUNGEN 11
2.4.1.2.1 7-NITROINDAZOL (7-NI) 11
2.4.1.2.2 3-BROMO-7-NITROINDAZOL (3-BROMO-7-NI) 11
2.4.1.3 ARGININ-ANALOGE 11
2.4.1.3.1 NA-NITRO-L-ARGININ (L-NNA) 11
2.4.1.3.2 NO-NITRO-L-ARGININMETHYLESTER (L-NAME) 11
2.4.1.3.3 L-THIOCITRULLIN (L-TC) 12
2.4.1.3.4 2-AMINO-5,6-DIHYDRO-6-METHYL-4H-1,3-THIAZIN.HCI (AMT.HCI) 12
2.4.2 NO-DONATOREN 13
2.4.2.1 DETANONATE 13
2.5 ANTISEREN UND ANTIKOERPER FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE 13
2.5.1 ANTISEREN UND BLOCKPUFFER 13
2.5.2 PRIMAERANTIKOERPOER 13
2.5.3 SEKUNDAERANTIKOERPER 15
2.6 AGRIN-EXPERIMENTE 15
2.6.1 CHEMIKALIEN UND LOESUNGEN 15
2.6.2 IMMUNFLUORESZENZ 16
2.7 PROTEINGEWINNUNG AUS ZELLEN UND GEWEBE 17
2.8 SDS-PAGE 17
2.8.1 COOMASSIEBLAU-FAERBUNG 18
2.9 CHEMIKALIEN, LOESUNGEN UND PUFFER FUER DIE PROTEINANALYSE 18
2.9.1 PROTEASEINHIBITOREN 18
2.
10 LOESUNGEN UND PUFFER FUER DEN WESTERN BLOT 19
2.10.1 ELEKTROBLOTTING 19
2.10.2 IMMUNREAKTION 19
2.10.2.1 ALLGEMEINE PUFFER UND ANTIKOERPERLOESUNGEN 19
2.10.2.2 IMMUNREAKTION MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 20
2.10.2.3 IMMUNREAKTION MIT DAB 20
2.11 IN SITU HYBRIDISIERUNG 21
2.11.1 MATERIALIEN UND LOESUNGEN FUER DIE PCR 21
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTS
VERZEICHNIS
2.11.2 MATERIALIEN UND LOESUNGEN FUER DIE TRANSKRIPTION 21
2.11.3 MATERIALIEN UND LOESUNGEN FUER DIE HYDROLYSE 22
2.11.4 LOESUNGEN FUER DIE FIXIERUNG UND VORBEHANDLUNG DER PRAEPARATE 22
2.11.5 MATERIALIEN UND LOESUNGEN FUER DIE HYBRIDISIERUNG 22
2.11.6 MATERIALIEN UND LOESUNGEN FUER DIE ENTWICKLUNG 24
2.12 AKTIVITAETSBESTIMMUNG DER NO-SYNTHASE 24
2.12.1 CHEMIKALIEN, LOESUNGEN UND MATERIALIEN 24
2.13 ANTISENSE (A)-EXPERIMENTE 25
2.13.1 CHEMIKALIEN, LOESUNGEN UND MATERIALIEN 25
2.14 ALLGEMEINE EINDECKMITTEL, LOESUNGEN UND PUFFER 26
2.15 CHEMIKALIENVERZEICHNIS 27
2.16 SONSTIGE HILFSMITTEL 31
2.17 GERAETE 31
3 METHODEN 32
3.1 ZELLKULTUR 32
3.1.1 ALLGEMEINE BEDINGUNGEN 32
3.1.2 KULTIVIERUNG VON ADHAERENTEN ZELLEN (MONOLAYERKULTUREN) 32
3.1.2.1 STAMMKULTUR DER C2C12-SKELETTMUSKEL-ZELLINIE 32
3.1.2.2 EXPERIMENTELLE KULTUR (C2C12) 32
3.1.2.3 STAMMKULTUR DER L8-SKELETTMUSKEL-ZELLINIE 33
3.1.2.4 EXPERIMENTELLE KULTUR (L8) 33
3.1.3 EINFRIEREN, LAGERUNG UND AUFTAUEN VON ZELLEN 33
3.1.4 BESCHICHTUNG DER GEWEBEKULTURPLATTEN, GLASPLAETTCHEN
UND OBJEKTTRAEGER 34
3.1.4.1 STERILISATION VON GLASPLAETTCHEN 34
3.1.4.2 COLLAGEN 34
3.1.4.3 POLY-L-ALPHA ORNITHIN (PORN) UND LAMININ 34
3.1.4.5 SILAN 34
3.1.4.6 SILIKONISIERUNG DER DECKGLAESCHEN 34
3.1.5 METHODEN ZUR ZELIZAHL- UND ZELLZYKLUSBESTIMMUNG 35
3.1.5.1 ZELLZAHLBESTIMMUNG 35
3.1.5.2 BESTIMMUNG DER GENERATIONSZEIT 35
3.1.5.3 BESTIMMUNG DES FUSIONSINDEX 36
3.1.5.4 TRYPANBLAUFAERBUNG (VITALFAERBUNG) 36
3.1.5.5 MESSUNG VON LEBENSFAEHIGKEIT UND WACHSTUM (MTT-TEST) 37
3.1.6 MYCOPLASMEN-KONTROLLE 37
3.1.7 UEBERSICHTSFAERBUNGEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER ZELLINIEN 37
3.1.7.1 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG (H.E.) 37
3.1.7.2 METHYLENBLAU-FAERBUNG 38
3.1.7.3 GIEMSAFAERBUNG 38
3.1.8 STIMULIERUNG DER ZELLEN FUER NO-ASSAY 38
3.1.8.1 WECHSELWIRKUNG MIT PHENOLROT 38
3.2 GEWEBEPRAEPARATION UND GEFRIERSCHNITTE 39
3.2.1 GENEHMIGUNG ZUR GEWEBEENTNAHME 39
3.2.2 GEWEBEPRAEPARATION 39
3.2.3 GEFRIERSCHNITTE 39
3.3 NACHWEIS SKELETTMUSKELSPEZIFISCHER ENZYME 39
3.3.1 AKTIN, MYOSIN UND MYOD 39
3.4 ENZYMHISTOCHEMIE 40
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1 NACHWEIS DER NO-SYNTHASE: AKTIVITAET, VERTEILUNG UND
INHIBITION 40
3.4.1.1 NADPH-DIAPHORASE (NADPHD) 40
3.4.1.2 NADPHD/LMMUNFLUORESZENZ-DOPPELFAERBUNG 41
3.4.2 INHIBITION DER NO-SYNTHASE 41
3.5 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 41
3.5.1 IMMUNFLUORESZENZ-MARKIERUNGEN AN ZELLEN UND
GEWEBESCHNITTEN 42
3.5.2 IMMUNFLUORESZENZ-DOPPELFAERBUNG 42
3.6 NOS UND AGRIN 42
3.6.1 AGRIN-INDUZIERTER ACHR-ASSAY UND IMMUNCYTOCHEMIE 42
3.7 PROTEINANALYSE 43
3.7.1 GEWINNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS MUSKELZELLEN 43
3.7.2 GEWINNUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS MUSKELGEWEBE 43
3.7.3 QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG 43
3.7.4 EINDIMENSIONALE SDS-PAGE 43
3.7.5 COOMASSIE-FAERBUNG VON SDS-GELEN 45
3.8 WESTERN BLOT
45
3.8.1 ELEKTROBLOTTING 45
3.8.2 IMMUNREAKTION 46
3.8.2.1 BLOCKIERUNG UNSPEZIFISCHER BINDUNGEN 46
3.8.2.2 IMMUNREAKTION MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 46
3.8.2.3 IMMUNREAKTION MIT DAB 46
3.8.3 AUSWERTUNG DER WESTERN BLOTS 47
3.9 IN SITU HYBRIDISIERUNG (ISH) 47
3.9.1 PLASMID ZUR HERSTELLUNG DER RNA-SONDE 47
3.9.2 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 48
3.9.3 FAELLUNG VON PCR-PRODUKTEN 50
3.9.4 NACHWEIS DER PCR-AMPLIFIKATIONSPRODUKTE MIT DER
GELELEKTROPHORESE 51
3.9.5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG (OD-MESSUNG) 50
3.9.6 IN VITRO-TRANSKRIPTION - RIBOSONDEN 50
3.9.7 PRAEZIPITATION DES RNAE-TRANSKRIPTS 51
YY 3.9.8 UEBERPRUEFUNG DES TRANSKRIPTIONSPRODUKTES MIT DER
GELELEKTROPHORESE 51
3.9.9 HYDROLYSE DES RNA-TRANSKRIPTS 52
3.9.10 AUFREINIGUNG DER RNA-SONDE 52
3.9.11 FIXIERUNG UND VORBEHANDLUNG DER PRAEPARATE 52
3.9.12 HYBRIDISIERUNG 53
3.9.13 ENTWICKLUNG 53
3.10 BESTIMMUNG DER NOS-AKTIVITAET 54
3.10.1 KOLORIMETRISCHER NITRAT/NITRIT-ASSAY 55
3.10.1.1 NITRAT- UND NITRIT-BESTIMMUNG 55
3.10.1.2 NITRITBESTIMMUNG 55
3.10.1.3 STANDARDS ZUR NITRIT- BZW. NITRAT-BESTIMMUNG 55
3.11 ANTISENSE (A)-VERSUCHE 56
4 STATISTIK UND COMPUTERPROGRAMME 56
INHALTSVERZEICHNIS
5
ERGEBNISSE 57
5.1 EXPRESSION DER NOS IM MUSKEL 57
5.1.1 LOKALISATION DER NOS I IN DER MUSKELENTWICKLUNG 57
5.2
WACHSTUM DER C2C12-ZELLINIE IN VITRO 61
5.2.1 ALLGEMEINE CHARAKTERISTIKA 61
5.2.1.1 MORPHOLOGIE 61
5.2.1.2 PROLIFERATIONSVERHALTEN 61
5.2.2 MYCOPLASMEN-KONTROLLE 62
5.2.3 VITALITAETSPRUEFUNG MITTELS TRYPANBLAU 62
5.3
LOKALISATION DER NOS I IN MYOGENEN KULTUREN 68
5.3.1 NOSAD/LMMUNFLUORESZENZ-DOPPELFAERBUNG 74
5.3.2 WESTERN BLOT-ANALYSE 77
5.3.3 LOKALISATION SKELETTMUSKELSPEZIFISCHER MARKER IN VITRO 79
5.4 NOSUNDAGRIN 83
5.4.1 AGRIN-INDUZIERTER ACHR-YYC/USFER"-ASSAY 83
5.4.2 KOLOKALISATION VON ACHR
-YYCLUSTET MIT RAPSYN, PSD-95
UND MUSK 86
5.4.3 AGRIN INDUZIERT ACHR UND NOS 88
5.4.4 KO-EXPRESSION VON NOS I UND LONEN-KANAL-PROTEINEN 90
5.5 IN SITU NACHWEIS VON NOS IN SKELETALER MUSKULATUR 93
5.5.1 HERSTELLUNG DES DNA-TEMP/AFE MIT HILFE DER PCR 93
5.5.2 EXPRESSION DER NOS I MRNA IN MYOGENEN KULTUREN 94
5.5.3 EXPRESSION DER NOS I MRNA IN IM MUSKELGEWEBE 94
5.5.4 EXPRESSION DER NOS I MRNA IN KONTROLLGEWEBEN 98
5.
6 TRANSFEKTION DER C2C12-ZELLEN MIT NOS I-ANTISENSE-OIIGONUKTEOTID 100
5.7 WIRKUNG VON ZYTOKINEN AUF DIE NO-BIOSYNTHESE 102
5.7.1 STANDARDISIERUNG DER NITRIWNITRAT-MESSUNG 102
5.7.2 WECHSELWIRKUNG MIT PHENOLROT 103
5.7.3 EFFEKTE DER ZYTOKIN-STIMULATION AUF DIE NO-PRODUKTION 103
5.7.4 EFFEKTE DER ADDITIVEN ZYTOKIN-STIMULATION AUF DIE
NO-PRODUKTION 104
5.7.5 EFFEKTE DER NOS-HEMMUNG AUF DIE NO-PRODUKTION IN VITRO 105
6 DISKUSSION 107
6
.1 IST DIE LOKALISATION DER NOS IN MYOGENEN KULTUREN DURCH DIE
MUSKELENTWICKLUNG ZU ERKLAEREN? 107
6.2 DIE NOS IST BESTANDTEIL VON AGRIN-INDUZIERTEN ACHR
-
YYCLUSTEM" AUF KULTIVIERTEN MYOTUBEN 108
6.3 NOSMRNA-EXPRESSION UND NO-GASSIGNAL IN DER MUSKELENT
WICKLUNG UND DER MYOBLASTENDIFFERENZIERUNG: IN VITRO-UNTER-
SUCHUNGEN 112
7
ZUSAMMENFASSUNG 115
8 LITERATURVERZEICHNIS 116
9 PUBLIKATIONEN 126
10 DANKSAGUNG 128
11 LEBENSLAUF 129 |
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| spelling | Lück, Gabriele Helga 1965- Verfasser (DE-588)122482204 aut Untersuchungen über Expression und Regulation der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) in Skelettmuskelzellen in vitro vorgelegt von Gabriele Helga Lück 2000 [7], 129 S. Ill., graph. Darst. : 30 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Berlin, Freie Univ., Diss., 2000 Hochschulschrift gtt Genregulation (DE-588)4122166-7 gnd rswk-swf Muskelzelle (DE-588)4127323-0 gnd rswk-swf Skelettmuskel (DE-588)4116511-1 gnd rswk-swf Stickstoffmonoxid-Synthase (DE-588)4481118-4 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Skelettmuskel (DE-588)4116511-1 s Muskelzelle (DE-588)4127323-0 s Stickstoffmonoxid-Synthase (DE-588)4481118-4 s Genregulation (DE-588)4122166-7 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009223977&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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