Molekularbiologische Erfassung der Thekazelldifferenzierung in Rinderfollikeln:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| adam_text | Titel: Molekularbiologische Erfassung der Thekazelldifferenzierung in Rinderfollikeln
Autor: Suhrbier, Wiebke
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung l
1.1 Anatomie des bovinen Ovars und Follikulogenese 2
1.2 Die Thekazelldifferenzierung 4
1.3 Die endokrine Regulation des bovinen Zyklus 5
1.4 Relaxin 8
1.5 relaxin-like factor (RLF) 10
1.6 Die regulatorischen Elemente der Transkription 12
1.6.1 Der basale Initiationskomplex 13
1.6.2 Transkriptionsfaktoren 14
1.6.2.1 Der steroidogenic factor- 1 (SF-1) 16
1.6.2.2 Das activator protein- 1 (AP-1) 16
1.6.2.3 Das CCAAT/Enhancer-binding protein ß
(C/EBPß) 17
2 Material und Methoden 18
2.1 Polymerasen-Kettenreaktion (PCR) 18
2.1.1 Inverse PCR 19
2.1.2 NestedPCR 22
2.2 Restriktionsverdau von DNA 23
2.3 Elektrophoretische Auftrennung von DNA 24
2.4 DNA-Transfer von einem Gel auf eine Nylonmernbran
(Southem blotting) 26
2.5 Herstellung einer nichtradioaktiven Sonde 27
2.6 Nichtradioaktive Hybridisierung 28
2.7 Herstellung einer radioaktiven Sonde durch
Random-Oligo (N)6-Priming 31
2.8 Herstellung einer radioaktiven Sonde durch
Auffüllen von 5 -Überhängen 32
2.9 Radioaktive Hybridisierung 33
2.10 Eluierung von DNA aus Agarosegelen 34
2.10.1 Eluierung von DNA mittels Qiaex 34
2.10.2 Eluierung von DNA mittels Membrantransfers 35
2.10.3 Elektroelution 36
2.11 DNA-Aufreinigung durch Phenolextraktion und
Ethanolpräzipitation 37
2.12 Klonierung von DNA-Fragmenten in Bakteriophagen 38
2.13 Screening einer genomischen Bank in Lambda-Phagen 38
2.13.1 Kultivierung der Wirtsbakterien 39
2.13.2 Titerbestimmung der Lambda-Phagen 40
2.13.3 Ausplattieren der genomischen Bank 41
2.13.4 Herstellung von Filterreplika 41
2.13.5 Hybridisierung der Filter 43
2.13.6 Identifizierung von spezifischen Lambda-Phagen 44
2.13.7 Präparation von DNA aus Lambda-Phagen 45
2.13.8 Entsalzung durch Dialyse 46
2.14 Subklonierung von DNA-Fragmenten 47
2.14.1 Dephosphorylierung des Vektors 47
2.14.2 Auffüllen von 5 -Überhängen 48
2.14.3 Entfernen von 3 -Überhängen 48
2.14.4 Ligation 49
2.14.5 Transformation 49
2.14.6 Plasmid-Isolierung aus Bakterien 51
2.15 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 51
2.15.1 Herstellung von Zellkemextrakten aus Gewebe 52
2.15.2 Präparafion von Thekazelien und Herstellung
von Zellkemextrakten 53
2.15.3 Band Shift Assay 55
3 Ergebnisse 58
3.1 Isolierung des RLF-Promotors aus einer genomischen
Bibliothek durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) 61
3.2 Isolierung des RLF-Promotors aus genomischer
DNA durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) 63
3.3 Isolierung des RLF-Promotors durch einen genomischen Blot 64
3.4 Klonierung flankierender genomischer Sequenzen mit Hiife
der inversen PCR 67
3.5 Screening einer bovinen Genbibliothek mit einer spezifischen
RLF-Sonde 70
3.6 Restriktionsanalyse der gewonnenen Lambdaklone 73
3.6.1 Restriktionsanalyse 1 73
3.6.2 Restriktionsanalyse 2 76
3.6.3 Restriktionsanalyse 3 78
3.6.4 Zusammenfassung der Restriktionsanalysen 80
3.7 Subklonierung und Sequenzierung der RLF-Promotorregion 81
3.8 Subklonierung und Sequenzierung der Klone 1 und 4 84
3.9 Identifizierung spezifischer Transkriptkmsbindungsstellen
per Computer 85
3.10 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 86
3.10.1 Herstellung der Fragmente 86
3.10.2 Kompetitionsexperiment mit Bindungssequenzen
für die Transkriptionsfaktoren SF-1, AP-1 und CEBPß 88
3.10.3 Kompetitionsexperiment zur Überprüfung
möglicher SF-i-Bindungsstelien 91
4 Diskussion 94
5 Zusammenfassung 100
6 Summary 102
7 Literatur 104
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Linearisiertes DNA-Fragment mit
unbekanntem Sequenzabschnitt 20
Inverse PCR vor Zirkularisierung 20
Inverse PCR mit zirkularisierter DNA 20
NestedPCR 22
Lambda DASH H-Bakteriophage mit Insertionsbereich 61
PCR mit genomischer Bibliothek 62
PCR mit genomischer DNA, basierend auf der Lokalisation
des JAK3- und des RLF-Gens bei Ratte und Maus 64
RLF-spezifische Sonde für genomischen Blot 65
Genomischer Blot 66
Genomische DNA 68
RLF-EcoRI-Fragment 68
Inverse PCR mit zirkularisiertem Eco RI-Fragment,
ca. 2,75 kb 69
Produkt der inversen PCR, in Vektor Iigiert, ca. 2,2 kb 69
Lambda EMBL3 Vektor 70
Primärscreening Klon Nr.3 71
Primärscreening Klon Nr.4 (exemplarisch für die schwach
hybridisierenden Klone) 71
Rescreen 3, Klon Nr. 3 72
Rescreen 3, Klon Nr. 4, exemplarisch für die schwach
hybridisierenden Klone. 72
Restriktionsanalyse 1, Gelphoto 74
Restriktionsanalyse 1, Autoradiographie. Zur
Verdeutlichung der Hybridisierungssignale wurden
die Klone Nr.l, Nr.4 und Nr.5 zwölf Stunden exponiert. 75
Abb. 21 Restriktionsanalyse 2, Gelphoto 77
Abb. 22 Restriktionsanalyse 2, Autoradiographie 77
Abb. 2
Abb. 3
Abb. 4
Abb. 5
Abb. 6
Abb. 7
Abb. 8
Abb. 9
Abb. 10
Abb. 11
Abb. 12
Abb. 13
Abb. 14
Abb. 15
Abb. 16
Abb. 17
Abb. 18
Abb. 19
Abb. 20
Abb. 23 Restriktionsanalyse 3, Gelphoto 79
Abb. 24 Restriktionsanalyse 3, Autoradiographie 79
Abb. 25 Restriktionskarte, RLF-Gen 80
Abb. 26 Mit EcoRI geschnittenes RLF-Fragment 81
Abb. 27 EcoRI/BamHI-Probeverdau der Ligationsansätze
des EcoRI-geschnittenen RLF-Fragmentes. Als positiv
mit einem jeweils 2,75 kb, 1,75 kb und 1 kb großen
Fragment erwiesen sich die Ansätze 1,4, 5, 7-12,
13, 17, 18, 20,21 und 24. 82
Abb. 28 Sequenz des RLF-Gens mit Promotorbereich
(Farbenerklärung unter 3.9) 83
Abb. 29 Die durch Restriktionsverdau gewonnenen Fragmente
unter Angabe ihrer Transkriptionsbindungsstellen 87
Abb. 30 „electrophoretic mobility shift assay Nr.l,
Bande Nr. 12 markiert 89
Abb. 31 „electrophoretic mobility shift assay Nr. 2 92
Abb. 32 Zusammengefaßte Daten über unterschiedliche ovarielle
mRNAs aus Primärzellkulturen boviner Granulosa- und
Thekazellen (modifiziert nach IVELL et al. 1999;
BATHGATE et al. 1999; UNGEFROREN et al. ! 994) 98
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