Funktionelle Charakterisierung des Spermienproteins SP47:
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2000
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adam_text | Titel: Funktionelle Charakterisierung des Spermienproteins SP47
Autor: Läkamp, Alexa
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 9
2 LITERATURÜBERSICHT 11
2.1 Der Genitalapparat des Ebers, Anatomie und Physiologie 11
2.1.1 Hoden 11
2.1.2 Nebenhoden 12
2.1.3 Samenleiter 13
2.1.4 Akzessorische Geschlechtsdrüsen 14
2.2 Das Spermatozoon 15
2.2.1 Spermienkopf 16
2.2.2 Spermienschwanz 16
2.2.3 Plasmamembran 17
2.3 Spennienreifting 19
2.3.1 Spermarogenese 19
2.3.2 Posttestikuläre Spermienreifung 20
2.3.3 Hoden- und Nebenhodenproteine 21
2.3.3.1 Akrosin/Proakrosin 22
2.3.3.2 Zonadhesin 23
2.3.3.3 Das Spermadhesin AWN 23
2.3.3.4 Die Proteine PH-20 und Fertilin , 24
2.3.3.5 Proteine der CRBP-Familie 26
2.3.3.6 HE-Proteine 27
2.4 Das Seminalplasma 29
2.5 Spermientransport im Weiblichen Genitaltrakt 29
2.5.1 Spermienreservoir im caudalen Isthmus des Eileiters 30
2.5.2 Kapazitation 3 i
2.5.3 Spermientransport zum Ort der Befruchtung 32
2.6 Die Eizelle 33
2.6.1 Die Zona pellucida 34
Inhaltsverzeichnis
2.7 Gameteninteraktion 35
2.7.1 Akrosomreaktion 36
2.8 Das Spermienprotein SP47 38
i EIGENE UNTERSUCHUNGEN 41
3.1 MATERIAL UND METHODEN 41
3.1.1 Isolierung des Milchproteins und Herstellung eines Antiserums 41
3.1.1.1 Isolierung von MGP aus boviner Milch 41
3.1.1.2 Vorbereitung der Probe zur Antikörper-Produktion 42
3.1.1.3 Charakterisierung des Milchproteins MGP 53/57
mittels Lektinbindungsstudien im Protein-BIot 43
3.1.1.4 Herstellung des Antiserums 44
3.1.1.5ÜberprüfungdesAntikörpersantiBTMGP53/57 45
3.1.2 Methoden zur biochemischen Charakterisierung von Proteinen 46
3.1.2.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 46
3.1.2.2 Western Blot 47
3.1.2.3 Proteinbestimmung nach Mikro-Biuret 49
3.1.3 Charakterisierung des porzinen Spermienproteins SP47 50
3.1.3.1 Gewebeextrakte 50
3.1.3.2 Spermienextrakte 50
3.1.4 Topographische Untersuchungen 51
3.1.4.1 Irnmunhistochemie 51
3.1.4.2 Indirekte Immunfluoreszenz 53
3.1.4.3 Vitalfärbung 58
3.1.4.3.1 Bestimmung der Zellvitalität mittles Propidiumjodid 58
3.1.4.3.2 Hoechst-Färbung 60
3.1.4.3.3 Auswertung und Dokumentation 60
3.1.4.4 Spermatozoon-Zona pellucida-Bindungstest 61
3.1 4.4.1 Modifizierter Spermatozoon-Zona pellucida
Bindungstest 62
3.1.4.4.2 Auswertung und Dokumentation des
Spermatozoon-Zona peliucida Bindungstest 62
3.1.4.5 BiotinilierungderZona-Giycoproteine 63
Inhaltsverzeichnis
3.1.4.6 Überprüfung der Bindung derSP47-homologen Milchproteine
im Western Blot 64
3.1.4.7 Statistische Auswertung 64
3.2 ERGEBNISSE 66
3.2.1 Isolierung des Milchproteins MGP 53/57 und Herrstellung
eines Antikörpers 66
3.2.1.1 Isolierung von MGP 53/57 aus boviner Milch 66
3.2.1.2 Charakterisierung des Milchproteins MGP 53/57 mittels Lektin-
bindungsstudien und Vorbereitung zur Antikörperproduktion 67
3.2.1.3 Überprüfung des Antikörpers anti BT MGP 53/57 72
3.2.2 Nachweis von SP47 in Geweben des Genitaltraktes des Ebers 73
3.2.2.1 Immunhistochemie 74
3.2.2.2 Gewebeextrakte Spermienextrakte 76
3.2.3 Nachweis von SP47 an Spermien 77
3.2.3.1 Immunfluoreszenz 77
3.2.3.2 Vitalfärbung 89
3.2.3.3 Spennienextrakte 91
3.2.3.4 Spermatozoon-Zona pellucida-Bindungstest 92
3.2.3.5 Zona pellucida Bindung der SP47 homologen Milchproteine
im Western Blot 97
4 DISKUSSION 98
4.1 Charakterisierung des Milchproteins MGP 53/57 und Herstellung
des polyklonalen Antikörpers anti BT MGP 53/57 99
4.2 Expression und Lokalisation des Spermienproteins SP47
im männlichen Genitale 102
4.3 SP47 während des Befruchtungsvorganges 106
4.4 Schlußbetrachtung 111
5 ZUSAMMENFASSUNG 112
6SUMMARY 114
7 LITERATURVERZEICHNIS 116
8 ANHANG A 138
9 ANHANG B 142
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