Irpexane und Gerronemine, neue cytotoxische und apoptoseauslösende Naturstoffe aus Basidiomyceten:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
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| Beschreibung: | 161 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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I
NHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
12
2.1
CHEMIKALIEN
.
12
2.2
MEDIEN
.
15
2.2.1
NAEHRMEDIEN
FUER
PILZE
UND
BAKTERIEN
.
15
2.2.2
MEDIEN
FUER
ZELLKULTUREN
.
18
2.3
PUFFER
UND
SALZLOESUNGEN
.
19
2.4
ENZYME
.
24
2.5
CONSENSUS-OLIGONUKLEOTIDE
.
25
2.6
PLASMIDVEKTOREN
.
25
2.7
ORGANISMEN
.
26
2.7.1
BEARBEITETE
PILZSTAEMME
.
26
2.7.2
TESTORGANISMEN
FUER
DIE
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.
26
2.7.2.1
BAKTERIEN
UND
PILZE
.
26
2.7.2.2
TESTSTAEMME
FUER
DEN
MUTAGENITAETSTEST
.
27
2.7.2.3
BAKTERIEN
FUER
DIE
TRANSFORMATION
.
27
2.7.2.4
ZELLINIEN
.
28
2.7.2.5
NEMATODEN
.
29
2.8
KULTIVIERUNG
DER PILZE
IN
SUBMERSKULTUR
.
29
2.8.1
FERMENTATION
IN
SCHUETTELKULTUR
.
29
2.8.2
FERMENTATION
DER
PRODUZENTENSTAEMME
IM
20
1
UND
100
1-MASSSTAB
.
30
2.8.3
FERMENTATIONSANALYSEN
.
31
2.8.3.1
PH-WERT
.
31
2.8.3.2
GLUCOSE-UND
MALTOSEBESTIMMUNG
.
32
2.8.3.3
MYCELTROCKENGEWICHT
.
32
2.8.3.4
ABGASANALYTIK
.
32
2.8.3.5
WIRKSTOFFBESTIMMUNG
MITTELS
ANALYTISCHER
HPLC
.
32
2.9
METHODEN
ZUR
REINIGUNG
UND
PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
DER
WIRKSTOFFE
.
34
2.9.1
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
34
2.9.2
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
35
2.9.3
HPLC-ANALYSE
.
36
2.9
4
SPEKTROSKOPIE
.
37
2.9.5
HPLC-MS
.
38
2.10
WEITERE
BIOLOGISCHE
METHODEN
.
39
2.10.1
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
39
2.10.2
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
NUKLEINSAEUREN
.
40
I
NHALTSVERZEICHNIS
2.10.2.1
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
.
40
2.10.2.2
YYMAXI
"
-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
MIT
PEG
.
40
2.10.2.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
40
2.10.3
GELELEKTROPHORESE
.
41
2.10.3.1
AGAROSE-GELE
.
41
2.10.3.2
POLYACRYLAMID-GELE
.
41
2.10.4
FAERBEN
VON
AGAROSE
UND
POLYACRYLAMID-GELEN
.
41
2.10.5
ENZYMREAKTIONEN
MIT
DNA
.
42
2.10.5.1
VERDAU
DER
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
42
2.10.6
DNA-PRAEZIPITATION
.
42
2.10.6.1
DNA-FAELLUNG
MIT
ETHANOL
.
42
2.10.6.2
DNA-FAELLUNG
MIT
ISOPROPANOL
.
42
2.11
METHODEN
ZUR
BIOLOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
.
43
2.11.1
NBT-DIFFERENZIERUNGSTEST
MIT
HL-60-ZELLEN
.
43
2.11.2
NBT-DIFFERENZIERUNGSTEST
MIT
U-937
ZELLEN
.
44
2.11.3
REPORTERGENASSAYS
.
44
2.11.3.1
REPORTERGENASSAY
ZUR
MESSUNG
DER
AP-1-,
RAR
UND
RXR-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
IN
HL-60-ZELLEN
.
47
2.11.3.2
REPORTERGENASSAY
ZUR
MESSUNG
DER
AP-1
UND
NF-KB-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
IN
COS-7
UND
HELA
S3-ZELLEN
.
47
2.11.3.3
COTRANSFEKTION
MIT
PFC-MEKI
.
48
2.11.4
UNTERSUCHUNG
INHIBITORISCHER
EFFEKTE
AUF
DIE
SEAP-ENZYMAKTIVITAET
.
48
2.11.5
CYTOTOXIZITAETSTEST
.
48
2.11.5.1
XTT-TEST
MIT
SUSPENSIONSZELLEN
.
48
2.11.5.2
GIEMSA-FAERBUNG
MIT
MONOLAYERKULTUREN
.
49
2.11.6
APOPTOSETEST
.
49
2.11.6.1
MORPHOLOGISCHE
BESTIMMUNG
DER
APOPTOSE
.
49
2.11.6.2
DNA-FRAGMENTIERUNGSGEL
.
49
2.11.7
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.
50
2.11.8
UNTERSUCHUNG
AUF
ATMUNGSHEMMUNG
.
50
2.11.9
AUFNAHME
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
JURKAT-ZELLEN
.
51
2.11.10
UNTERSUCHUNG
DER
HEMMUNG
DES
ACETAT-EINBAUS
.
51
2.11.11
REAKTION
MIT
L-CYSTEIN
.
52
2.11.12
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
DER
SUBSTANZEN
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
VERSCHIEDENER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
MIT
HILFE
DES
GELSHIFT-ASSAYS
.
52
2.11.12.1
HERSTELLUNG
DER
ZELLEXTRAKTE
FUER
DEN
GELSHIFT-ASSAY
(AP-1,
NF
K
B)
.
52
2.11.12.2
HERSTELLUNG
DER
KEMEXTRAKTE
FUER
DEN
GELSHIFT-ASSAY
(AP-1,
NF
K
B)
.
53
2.11.12.3
MARKIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.
53
2.11.13
GELSHIFT
ASSAY
.
54
2.11.14
WESTERN
BLOTS
.
55
2.11.14.1
IKB-WESTEM-BLOT
IN
HELA
S3-ZELLEN
.
55
2.11.14.2
COX-2
WESTEM-BIOT
IN
J774A.
1
UND
RAW
264.7-ZELLEN
.
56
2.11.15
UNTERSUCHUNG
ZUM
EINFLUSS
VON
WIRKSTOFFEN
AUF
DIE
INTERLEUKINPRODUKTION
IN
JURKAT-ZELLEN
.
56
2.11.16
NATIVES
AKTIVITAETSGEL
.
57
2.11.17
UNTERSUCHUNG
AUF
MORPHOLOGISCHE
VERAENDERUNG
.
57
2.11.18
HEMMUNG
DER
APPRESSORIENBILDUNG
BEI
MAGNAPORTHE
GRISEA
.
58
2.11.19
WEITERE
BIOLOGISCHE
TESTMETHODEN
.
58
2.11.19.1
AGARDIFFUSIONSTEST
MIT
PILZEN
UND
BAKTERIEN
.
58
2.11.19.2
HAEMOLYSETEST
.
58
2.11.19.3
MUTAGENITAETSTEST
NACH
ARNES
.
58
2.11.19.4
TEST
AUF
NEMATIZIDE
AKTIVITAET
.
59
2.11.19.5
HEMMUNG
DER
THROMBOCYTENAGGREGATION
.
59
I
NHALTSVERZEICHNIS
3
ERGEBNISSE
.
60
3.1
EFFEKTOREN
DER
AP-1
UND
NF
K
B-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
IN
COS-7-ZELLEN
.
60
3.2
ISOLIERUNG
VON
IM
SCREENING
AUF
EFFEKTOREN DER
AP-1
UND
NF
K
B
VERMITTELTEN SIGNALTRANSDUKTION
POSITIV
AUFGEFALLENEN
SUBSTANZEN
.
60
3.2.1
IRPEXANE
A-E
AUS
IRPEX
SP.,
TA
93028
.
60
3.2.1.1
PRODUKTIONSSTAMM
IRPEX
SP.,
TA
93028
.
60
3.2.1.2
FERMENTATION
VON
IRPEX
SP.,
TA
93028
.
61
3.2.1.3
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
IRPEXANE
A-E
AUS
IRPEX
SP.,
TA
93028
.
61
3.3
PHYSIKALISCH-CHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.
62
3.3.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
64
3.3.2
ANALYTISCHE
HPLC
.
65
3.3.3
SPEKTROSKOPIE
.
65
3.4
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
IRPEXANE
A-E
.
71
3.4.1
CYTOTOXIZITAET
.
71
3.4.2
WIRKUNG
DER
VERBINDUNGEN
IM
REPORTERGEN-ASSAY
.
71
3.4.2.1
REPORTERGENASSAY
ZUR
MESSUNG
DER
AP-1
UND
NF
K
B
ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
IN
COS-7-ZELLEN
.
72
3.4.2.2
COTRANSFEKTION
MIT
PFC-MEKL
IN
COS-7-ZELLEN
.
73
3.4.3
REPORTERGENASSAY
ZUR
MESSUNG
DER
AP-1-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
IN
HELA
SS
ZELLEN
.
74
3.4.4
GELSHIFT-ASSAYS
MIT
ZELLEXTRAKTEN
UND
KEMEXTRAKTEN
.
75
3.4.5
I-KB-WESTEM
BLOT
IN
HELA
S3-ZELLEN
.
76
3.4.6
COX-2
WESTERN
BLOT
IN
J774A.
1-ZELLEN
UND
RAW
264.7-ZELLEN
.
78
3.4.7
UNTERSUCHUNG
ZUM
EINFLUSS
DER
WIRKSTOFFE
AUF
DIE
INTERLEUKIN-2
PRODUKTION
IN
JURKATZELLEN
.
80
3.4.8
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.
81
3.4.9
AUFNAHME
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SUBSTANZEN
IN
JURKAT-ZELLEN
.
83
3.4.10
UNTERSUCHUNG
AUF
ATMUNGSHEMMUNG
.
84
3.4.11
UNTERSUCHUNG
DER
HEMMUNG
DES
ACETAT-EINBAUS
.
85
3.4.12
NATIVES
AKTIVITAETSGEL
.
85
3.4.13
NBT
-DIFFERENZIERUNGSTEST
.
85
3.4.14
APOPTOSETEST
.
85
3.4.15
UNTERSUCHUNG
AUF
MORPHOLOGISCHE
VERAENDERUNG
.
85
3.4.16
ANTIMIKROBIELLES
WIRKUNGSSPEKTRUM
.
87
3.4.17
HEMMUNG
DER
APPRESSORIENBILDUNG
BEI
MAGNAPORTHE
GRISEA
.
88
3.4.18
WEITERE
BIOLOGISCHE
TESTSYSTEME
.
89
3.5
SCREENING
NACH
INDUKTOREN
DER
DIFFERENZIERUNG
UND
APOPTOSE
VON
HL-60-ZELLEN
AUS
PILZEN
.
90
3.6
ISOLIERUNG
VON
IM
SCREENING
NACH
INDUKTOREN
DER
DIFFERENZIERUNG
UND
APOPTOSE
VON
HL-60-ZELLEN
POSITIV
AUFGEFALLENEN
VERBINDUNGEN
.
90
3.6.1
GERRONEMINE
A-F
AUS
GERRONEMA
SP.,
TA
86053
.
90
3.6.1.1
PRODUKTIONSSTAMM
GERRONEMA
SP.
(SUBGATTUNG
ROMAGNESIA),
TA
86053
.
90
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.6.1.2
FERMENTATION
VON
GERRONEMA
SP.,
TA
86053
.
91
3.6.1.3
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
GERRONEMINE
A-F
AUS
GERRONEMA
SP.,
TA
86053
.
93
3.6.1.4
PHYSIKALISCH-CHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
GERRONEMINE
A-F
.
94
3.6.1.4.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
95
3.6.1.4.2
ANALYTISCHE
HPLC
.
96
3.6.1.4.3
SPEKTROSKOPIE
.
97
3.7
BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
GERRONEMINE
A-E
.
103
3.7.1
INDUKTOREN
DER
DIFFERENZIERUNG
HUMANER
LEUKAEMIEZELLINIEN
.
103
3.7.1.1
DIFFERENZIERUNG
VON
HL-60-ZELLEN
.
103
3.7.1.1.1
WIRKUNG
BEKANNTER
DIFFERENZIERUNGSINDUKTOREN
AUF
HL-60-ZELLEN
.
105
3.7.1.2
DIFFERENZIERUNG
VON
U937-ZELLEN
.
106
3.7.1.3
DIFFERENZIERUNGSINDUKTOREN
AUS
PILZEN
.
109
3.7.2
BESTIMMUNG
DER
APOPTOSEINDUKTION
IN
HL-60-ZELLEN
.
110
3.7.2.1
MORPHOLOGISCHE
AUSWERTUNG
DER
APOPTOSEINDUKTION
.
110
3.7.2.2
DNA-FRAGMENTIERUNGSGEL
.
;
.
113
3.7.3
CYTOTOXIZITAET
DER
GERRONEMINE
A-E
.
114
3.7.4
REPORTERGENASSAYS
ZUR
UNTERSUCHUNG
EINER
EINFLUSSNAHME
AUF
VERSCHIEDENE
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADEN
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
.
118
3.7.4.1
REPORTERGENASSAYS
IN
HL-60-ZELLEN
.
118
3.7.4.1.1
RAR
UND
RXR-ABHAENGIGE
REPORTERGENEXPRESSION
IN
HL-60-ZELLEN
.
119
3.7.4.1.2
AP
1
-ABHAENGIGE
REPORTERGENEXPRESSION
IN
HL-60-ZELLEN
.
119
3.7.4.2
AP
1
-ABHAENGIGE
REPORTERGENEXPRESSION
IN
COS-7-ZELLEN
.
120
3.7.5
EINBAU
RADIOAKTIV
MARKIERTER
VORSTUFEN
IN
SAEUREFAELLBARES
MATERIAL
IN
VIVO
.
121
3.7.6
UNTERSUCHUNG
AUF
ATMUNGSHEMMUNG
.
123
3.7.7
REAKTION
MIT
L-CYSTEIN
.
123
3.7.8
AGARDIFFUSIONSTEST
MIT
PILZEN
UND
BAKTERIEN
.
123
4
DISKUSSION
.
125
4.1
EFFEKTOREN
DER
AP-1
UND
NF
K
B-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
.
125
4.1.1
BEKANNTE
VERBINDUNGEN
AUS
VERSCHIEDENEN
IRPEXSPEZIES
.
127
4.1.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
WIRKMECHANISMUS
.
128
4.2
INDUKTOREN
DER
APOPTOSE
.
136
4.2.1
BEKANNTE
VERBINDUNGEN
AUS
VERSCHIEDENEN
GERRONEMASPEZIES
.
142
4.2.2
WIRKMECHANISMUS
.
143
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
146
5.1
EFFEKTOREN
DER
AP-1
UND
NF
K
B-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
.
146
5.2
INDUKTOREN
DER
APOPTOSE
.
147
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
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