Expression von Genen der Riboflavin- und Terpenbiosynthese und Charakterisierung der entsprechenden Proteine:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
RIBOFLAVINBIOSYNTHESE
1
1.1.1
BIFUNKTIONELLE
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
SYNTHASE
/
GTP
4
CYCLOHYDROLASE
II
1.2
TERPENBIOSYNTHESE
5
1.2.1
DIE
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
8
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
1
2.1
GERAETE
10
2.2
MATERIALIEN
11
2.2.1
CHEMIKALIEN
11
2.2.2
ENZYME
11
2.2.3
PUFFER
11
2.2.4
KULTURMEDIEN
18
2.2.5
MIKROORGANISMEN
19
2.2.6
KLONIERUNGSVEKTOREN
19
2.3
KULTIVIERUNG
VON
MIKROORGANISMEN
20
2.3.1
KULTIVIERUNG
UND
STAMMHALTUNG
VON
E.
COLI
20
2.3.2
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
20
2.3.3
KULTIVIERUNG
UND
STAMMHALTUNG
VON
S.
FRUGIPERDA
21
2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITSTECHNIKEN
21
2.4.1
PLASMIDISOLIERUNG
DURCH
HITZESCHOCK
21
2.4.2
PLASMIDISOLIERUNG
MITTELS
LONENTAUSCHER
22
2.4.3
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
ODER
REAKTIONSANSAETZEN
22
2.4.4
DNA-ISOLIERUNG
AUS
PFLANZENMATERIAL
23
2.4.5
RNA-ISOLIERUNG
AUS
PFLANZENMATERIAL
23
2.4.6
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
25
2.4.7
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
25
2.4.8
RESTRIKTION
VON
DNA
26
2.4.9
LIGATION
VON
DNA
26
2.4.10
IN-VITRO-AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
27
2.4.11
PCR-SCREENING
29
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.12
5
'
-RACE
29
2.4.13
NORTHERN
BLOT
32
2.4.14
ELEKTROTRANSFORMATION
34
2.4.15
TRANSFEKTION
MIT
CELLFECTIN
35
2.4.16
DNA-SEQUENZIERUNG
35
2.5
PROTEINREINIGUNG
38
2.5.1
EXPRESSION
IN
E.
COLI
38
2.5.2
AUFSCHLUSS
VON
E.
CO/I-ZELLEN
38
2.5.3
EXPRESSION
IN
5.
FRUGIPERDA
39
2.5.4
AUFSCHLUSS
VON
S.
FRUGIPERDA-EE\\M
39
2.5.5
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
40
2.5.6
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
40
2.5.7
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
AMYLOSE-HARZ
41
2.5.8
METALL-AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
41
2.5.9
GELFILTRATION
41
2.5.10
CHROMATOGRAPHIE
AUF
HYDROXYL-APATIT
42
2.5.11
BESTIMMUNG
DER
GESAMTPROTEINMENGE
NACH
BRADFORD
42
2.5.12
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
43
2.6
ENZYMASSAYS
44
2.6.1
BESTIMMUNG
DER
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON
KINASE
AKTIVITAET
44
2.6.2
BESTIMMUNG
DER
KINASE
AKTIVITAET
MITTELS
3I
P-NMR
44
2.6.3
BESTIMMUNG
DER
GTP-CYCLOHYDROIASE
II
AKTIVITAET
45
2.6.4
BESTIMMUNG
DER
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
SYNTHASE AKTIVITAET
45
2.6.5
BESTIMMUNG
DER
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
AKTIVITAET
46
MITTELS
"
C-NMR
2.6.6
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
46
SYNTHASE
AKTIVITAET
2.6.7
BESTIMMUNG
DER
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT REDUKTOISOMERASE
48
AKTIVITAET
INHALTSVERZEICHNIS
3.
ERGEBNISSE
49
3.1
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON
KINASE
49
3.1.1
EXPRESSION
DES
DHBK-GENS
AUS
LYCOPERSICON
ESCULENTUM
IN
ESCHERICHIA
COLI
49
3.1.2
AMPLIFIKATION
DES
DHBK-GENS
AUS
CHROMOSOMALER
TOMATEN
DNA
51
3.1.3
UNTERSUCHUNG
DER
ENZYMATISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DES
/AEM-GENPRODUKTS
52
3.2
BIFUNKTIONELLE
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
SYNTHASE
/
GTP-
56
CYCLOHYDROLASE
II
3.2.1
SEQUENZBESTIMMUNG
DES
RIBA-GENS
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
56
3.2.2
EXPRESSION
DES
RZM-GENS
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
IN
ESCHERICHIA
COLI
59
3.2.3
KOMPLEMENTIERUNGSEXPERIMENTE
MIT
RIBA
AUS
A.
THALIANA
60
3.2.4
EXPRESSION
DES
RIBA-GENS
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
ALS
FUSIONSPROTEIN
61
3.2.5
REINIGUNG
DER
MBP-RIBA(S)-FUSIONSPROTEINE
63
3.2.6
KLONIERUNG
DES
RIBA
GENS
AUS
LYCOPERSICON
ESCULENTUM
65
3.2.7
EXPRESSION
DES
RI/ A-GENS
AUS
LYCOPERSICON
ESCULENTUM
IN
ESCHERICHIA
COLI
67
3.3
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
68
3.3.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
ZTO-GENS
AUS
ESCHERICHIA
COLI
68
3.3.2
NMR-ASSAY
DER
L-DESOXY-D-XYIULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
68
3.3.3
REINIGUNG DER
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
AUS
E.
COLI
70
3.3.4
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
ZTO-GENS
AUS
VERSCHIEDENEN
ANDEREN
71
ORGANISMEN
3.3.5
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
ZLVS-GENS
AUS
A.
THALIANA
IN
SPODOPTERA
74
FRUGIPERDA
3.3.6
REINIGUNG
DER L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
AUS
BACILLUS
77
SUBTILIS
3.3.7
ENZYMATISCHE
SYNTHESE
VON
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPBAT
79
3.3.8
ENZYMATISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
L-DESOXY-D-XYIULOSE-5-PHOSPHAT
80
SYNTHASE
AUS
BACILLUS
SUBTILIS
3.4
KLONIERUNG
DES
YGBB-GENS
AUS
ESCHERICHIA
COLI
83
INHALTSVERZEICHNIS
4.
DISKUSSION
86
4.1
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON
KINASE
86
4.2
BIFUNKTIONELLE
3,4-DIHYDROXY-2-BUTANON-4-PHOSPHAT
SYNTHASE
/
GTP
90
CYCLOHYDROLASE
II
4.3
L-DESOXY-D-XYLULOSE-5-PHOSPHAT
SYNTHASE
97
4.4
DIE
ROLLE
VON
YGBB
IN
DER
TERPENBIOSYNTHESE
101
5.
ZUSAMMENFASSUNG
103
6.
LITERATURVERZEICHNIS
106
ANHANG
A:
CDNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
RIBA
AUS
A.
THALIANA
116
ANHANG
B:
CDNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
RIBA
AUS
L.
ESCULENTUM
121
ANHANG
C:
DNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
DXS
AUS
E.
COLI
125
ANHANG
D:
DNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
DXS
AUS
B.
SUBTILIS
129
ANHANG
E:
DNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
YGBB
AUS
E.
COLI
133
ANHANG
F
:
ALS
PRIMER
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
134 |
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