Untersuchungen am Eisen- und Stickoxid-Stoffwechsel von Zellen der humanen Haut unter UV-Einfluss:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
LITERATURBEFUNDE
3
2.1
DIE
HAUT
ALS
ORGAN
3
2.2
LICHT
UND
HAUT
6
2.3
STICKOXID-BIOSYNTHESE
UND
BIOCHEMLSCHE'CHARAKTERISIERUNG
DES
MOLEKUELS
8
2.4
ZELLULAERER
EISENSTOFFWECHSEL
11
2
4.1
NOTWENDIGKEIT
DER
HOMOEOSTATISCHEN
REGULATION
DES
EISENSTOFFWECHSELS
IN
SAEUGERZELLEN
11
2.4
2
PROZESSE
ZUR
REGULATION
UND
AUFRECHTERHALTUNG
DER
ZELLULAEREN
EISENHOMOEOSTASE
12
2.5
VERTEIDIGUNG
GEGEN
OXIDATIVEN
STRESS
-
DAS
ANTIOXLDANSSYSTEM
DER
HAUT
16
2.5
1
NICHT-ENZYMATISCHE,
HYDROPHILE
ANTIOXIDANTIEN
DER
HAUT
17
2.5.2
NICHT-ENZYMATISCHE,
LIPOPHILE
ANTIOXIDANTIEN
DER
HAUT
17
2.5.3
ENZYMATISCHE
ANTIOXIDANTIEN
DER
HAUT
18
2.6
DAS
ATOPISCHE
EKZEM
(AE)
18
2.7
ZIEL
DER
ARBEIT
19
3
MATERIAL
UND
METHODEN
21
3.1
MATERIAL
21
3.1.1
STANDARD-LABORGRAETE
21
3.1.2
GERAETE
UND
MATERIAL
FUER
ZELLKULTURARBEITEN
22
3
1
3
GERAETE
UND
MATENAL
FUER
HISTOLOGISCHE
ARBEITEN:
22
3.1.4
GERAETE
UND
MATERIAL
FUER
GELELEKTROPHORETISCHE
ARBEITEN
23
3.1.5
MATERIAL
FUER
DIE
TRANSFERRINREZEPTOR
UND
FERRITINMESSUNG
24
3.1.6
CHEMIKALIEN
24
3.2
METHODEN
27
3.2.1
PRAEPARATION
VON
HAUTMATERIAL
27
3.2.1.1
PUNCHBIOPSIEN
27
3.2.1.2
SAUGBLASENEPIDERMIS-PRAEPARATION
27
3.2.2
ZELLKULTUR
28
3.2
2
1
ISOLIERUNG
EPIDERMALER
UND
DERMALER
ZELLEN
AUS
HAUTBIOPSIEN 28
3.2
2
2
KULTIVIERUNG
UND
SUBKULTIVIERUNG
EPIDERMALER
PRIMAERISOLATE
30
3
2.2
3
KULTIVIERUNG
UND
SUBKULTIVIERUNG
DERMALER
FIBROBLASTEN
30
3.2.2
4
ISOLIERUNG
VON
GEMISCHTEN
EPIDERMALEN
ZELLEN
AUS
SAUGBLASENEPIDERMIS
30
3.2.3
HISTOLOGISCHE
ARBEITEN
31
3.2.3.1
ANFERTIGUNG
VON
KRYOSTATSCHNITTEN
UND
FIXIERUNG
31
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3
2
IMMUNHISTOCHEMISCHE
NACHWEISMETHODEN
32
3.2
3.3
BILDANALYTISCHE
AUSWERTUNG
HISTOLOGISCHER
PRAEPARATE
33
3.2.4
ERSTELLUNG
VON
ZELLULAEREN
EXTRAKTEN
UND
PROTEINBESTIMMUNG
1
33
3.2.4.1
GEWINNUNG
DER
ZELLULAEREN
EXTRAKTE
AUS
KULTIVIERTEN
ZELLEN
34
3.2
4
2
GEWINNUNG
DER
ZELLULAEREN
EXTRAKTE
AUS
SAUGBLASENEPIDERMIS
35
3
2.4
3
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
NACH
BRADFORD
35
3
2
5
WESTERN
BLOTTMG
35
3.2
5
1
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
35
3
2.5.2
ELEKTRO-BLOT
37
3
2.5
3
GELFAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
G-250
38
3.2.5.4
IMMUNOCHEMISCHE
DETEKTION
39
3.2
6
FERRITIN-NACHWEISMETHODEN
AN
ZELLULAEREN
EXTRAKTEN
40
3.2.6
1
WESTERN
BLOT-SPEZIFIKATIONEN
FUER
DEN
FERRITIN-NACHWEIS
40
3.2.6
2
FERRITIN-ELISA
41
3
2.7
BESTIMMUNG
DES
FREIEN
INTRAZELLULAEREN
EISENPOOLS
42
3.2.8
BESTIMMUNG
DES
TRANSFERRIN-REZEPTOR
(TFR)
GEHALTES
IN
ZELLULAEREN
EXTRAKTEN 43
3.2.9
NO-SYNTHASE
NACHWEIS
AN
ZELLULAEREN
EXTRAKTEN 43
3.2.9.1
WESTERN
BLOT-SPEZIFIKATIONEN
FUER
DEN
NO-SYNTHASE
NACHWEIS 44
3.2
9
2
MIKROTITER-ASSAYS
FUER
DEN
INOS
NACHWEIS
44
3.2.10
UNTERSUCHUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
FREISETZUNG
VON
RADIKALISCHEM
NO
DURCH
4,5
DIAMINOFLUORESCEIN-DIACETAT
(DAF-2-DA)
46
3.2.11
UNTERSUCHUNG
VERSCHIEDENER
ALLGEMEINER
PARAMETER
DER
ZELLPHYSIOLOGIE
46
3.2.11.1
BESTIMMUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
ESTERASEFUNKTION
(ALS
ZELLULAERER
VITALITAETSNACHWEIS)
47
3.2.11
2
BESTIMMUNG
DES
FREIEN
INTRAZELLULAEREN
PEROXIDSTATUS
47
3.211.3
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
ZELLZAHL
48
3.2.12
IN
VITRO
UVA
SOWIE
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
SOLARSIMULATOR-BESTRAHLUNG
48
3.2.12.1
UVA-BESTRAHLUNG
UND
SOLARSIMULATION
IN
VITRO
49
3.2.12.2
SOLARSIMULATION
IN
VIVO
UND
BESTIMMUNG
DER
MINIMALEN
ERYTHEMALEN
DOSIS
(MED)
50
3.2.13
INKUBATION
DER
ZELLEN
MIT
ANTIOXIDANTIEN
50
3
2
13
1
ANTIOXIDANSVORBEHANDLUNG
IN
VITRO
50
3.2.13
2
ANTIOXIDANSVORBEHANDLUNG
IN
SITU
51
3.14
MATHEMATISCH
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
52
4
ERGEBNISSE
53
4.1
VALIDIERUNGSEXPERIMENTE
53
4.1
1
VALIDIERUNG
DES
FERRITIN-ELISA
53
4.1.2
VALIDIERUNG
DES
TRANSFERRINREZEPTOR-ELISA
FUER
DIE
VERWENDUNG
AN
HAUTZELLEXTRAKTEN
55
4
1.3
VALIDIERUNG
DES
NO-NACHWEISES
MIT
4,5-DIAMINOFLUORESCEM-DIACETAT
58
4.1
4
VORVERSUCHE
ZUR
SPEZIFIKATION
VERSCHIEDENER
NO-SYNTHASE
ANTIKOERPER
61
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
GRUNDSTATUS
DES
EISEN
UND
NO-STOFFWECHSELS
IN
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
63
4
2
1
IMMUNHISTOCHEMISCHE
DARSTELLUNG
DES
FERRITINS
IN
DER
HAUT
63
4
2
2
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNG
ZUM
FERNTM-GRUNDSTATUS
IN
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
64
4
2.2
1
FERRITIN-GRUNDSTATUS
IN
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
ALTER
UND
GESCHLECHT
66
4.2.3
VERGLEICHENDE
IMMUNHISTOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
INOS
VERTEILUNG
IN
DER
HAUT
69
4.2
4
NO-SYNTHASE-GRUNDSTATUS
UND
NO-FREISETZUNG
IN
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
70
4.2
4.1
NO-SYNTHASEN
IN
FIBROBLASTEN
UND
KERATINOZYTEN
70
4
2.4
3
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNG
DER
NO-FREISETZUNG
IM
GRUNDSTATUS
BEI
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
71
4.3
EINFLUSS
VON
UV-LLCHT
AUF
VERSCHIEDENE
ELSEN
UND
NO-STOFFWECHSELPARAMETER
BEI
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
72
4
3.1
VERAENDERUNG
DER
FERNTMKONZENTRATIONEN
IN
FIBROBLASTEN
UND
KERATINOZYTEN
NACH
EINMALIGER
IN
VITRO
UVA-BESTRAHLUNG
ODER
SOLARSIMULATION
VERSCHIEDENER
INTENSITAETEN
72
4.3
2
VERAENDERUNGEN
DES
INTRAZELLULAEREN
FREIEN
EISENPOOLS
IN
FIBROBLASTEN
UND
KERATINOZYTEN
DIREKT
UND
24
STUNDEN
NACH
UV-BESTRAHLUNG
76
4.3
3
INOS
STATUS
VON
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
NACH
UV-BESTRAHLUNG
78
4
3.4
NO-FREISETZUNG
BEI
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
NACH
UV-BESTRAHLUNG.
81
4.4
MODULATION
VON
EISEN
UND
NO-STOFFWECHSELPARAMETEM
IN
FIBROBLASTEN
UND
KERATINOZYTEN
DURCH
ANTIOXIDANSLNKUBATLON
83
4 4
1
EINFLUSS
DER
ANTIOXIDANS-INKUBATION
AUF
DIE
FERRITINKONZENTRATION
IN
DERMALEN
FIBROBLASTEN
83
4
4
2
EINFLUSS
DER
ANTIOXIDANS-INKUBATION
AUF
DIE
FERRITINKONZENTRATION
IN
EPIDERMALEN
KERATINOZYTEN
85
4.4.3
UEBERPRUEFUNG
DER
RELATIVEN
ZELLZAHL,
DER
KONZENTRATION
AN
LOESLICHEN
PEROXIDEN
UND
DER
ESTERASEFUNKTIONALITAET
BEI
FIBROBLASTEN
UND
KERATINOZYTEN
NACH
INKUBATION
MIT
ANTIOXIDANTIEN
86
4.4
4
UNTERSUCHUNG
DES
FREIEN
EISENPOOLS
IN
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
NACH
ANTIOXIDANS
INKUBATION
87
4
4.5
TRANSFERRINREZEPTOR
(TFR)-BESTIMMUNG
AN
DERMALEN
FIBROBLASTEN
NACH
ANTIOXIDANS-INKUBATION
87
4
4.6
EINFLUSS
DER
ANTIOXIDANS-INKUBATION
AUF
DIE
FREISETZUNG
VON
NO
IN
DERMALEN
FIBROBLASTEN
UND
EPIDERMALEN
KERATINOZYTEN
88
4.5
EISEN
UND
NO-STOFFWECHSEL-BEELNFLUSSUNG
DURCH
ANTIOXLDANS-VORINKUBATION
DERMALER
FIBROBLASTEN
UND
EPIDERMALER
KERATINOZYTEN
BEI ANSCHLIESSENDER
UV-BESTRAHLUNG
89
4.5
1
EINFLUSS
VON
UVA-LICHT
AUF
DEN
FERRITINSTATUS
VON
FIBROBLASTEN
NACH
VORINKUBATION
MIT
ANTIOXIDANTIEN
90
4
5.2
EINFLUSS
VON
UVA-LICHT
UND
SOLARSIMULATION
AUF
DEN
FERRITINSTATUS
VON
KERATINOZYTEN
NACH
VORINKUBATION
MIT
ANTIOXIDANTIEN
91
4
5
3
EINFLUSS
VON
UVA-LICHT
UND
SOLARSIMULATION
AUF
DEN
FERRITINSTATUS
VON
HAUTZELLEN
BEI
SUPPLEMENTIERUNG
DER
ANTIOXIDANTIEN
DIREKT
NACH
BESTRAHLUNG
93
III
INHALTSVERZEICHNIS
4
5.4
VERAENDERUNGEN
DER
INTRAZELLULAEREN
NO-FREISETZUNG
UND
DER
FREIEN
EISENKONZENTRATION,
IN
DERMALEN
FIBROBLASTEN
UND
KERATMOZYTEN,
NACH
VORINKUBATION
MIT
ANTIOXIDANTIEN
UND
ANSCHLIESSENDER
UVA-BESTRAHLUNG
94
4.6
EINFLUSS
VON
TOPISCH
APPLIZIERTEM
VITAMIN
C
AUF
DIE
EPIDERMALE
FERRITLN-KONZENTRATION
NACH
SOLARSIMULATION
96
4.7
VERGLEICH
DER
FERRLTIN
UND
EISENKONZENTRATION
SOWIE
DER
NO-FREISETZUNG
IN
ZELLEN
AUS
NORMALHAUT-BIOPSIEN
UND
NLCHT-LUESLONALEN
AREALEN
VON
PATIENTEN
DER
ATOPISCHEN
DERMATITIS
(AE-PATIENTEN)
98
4.7
1
FERNTINKONZENTRATION
IN
HAUTZELLEN
VON
GESUNDEN
SPENDERN
UND
AE-PATIENTEN
IM
GRUNDZUSTAND
UND
NACH
UV-BESTRAHLUNG
99
4
7
2
UNTERSUCHUNG
DES
FREIEN
EISENPOOLS
VON
FIBROBLASTEN
NORMALHAEUTIGER
SPENDER
UND
AE-
PATIENTEN
IM
GRUNDSTATUS
UND
NACH
UVA-BESTRAHLUNG
101
4.7.3
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNG
DER
NO-FREISETZUNG
IN
FIBROBLASTEN
VON
NORMALHAEUTIGER
SPENDER
UND
PATIENTEN
DER
ATOPISCHEN
DERMATITIS
NACH
UVA-BESTRAHLUNG
102
5
DISKUSSION
103
5.1
BEDEUTUNG
DES
EISENSTOFFWECHSEL*
UND
OXIDATIVER
EINFLUESSE
FUER
DIE
HAUT
103
5.2
METHODENVALIDIERUNG
104
5.3
BEDEUTUNG
DER
GRUENDETET!
DES
NO
UND
EISENMETABOLISMUS
FUER
DIE
WEITEREN
UNTERSUCHUNGEN
106
5.4
AUSWIRKUNGEN
VON
UV-BESTRAHLUNG
ALS
PHYSIOLOGISCHEM
STRESSOR
AUF
EISENSTOFFWECHSEL
UND
NO-SYNTHASEN
108
5.5
ANTIOXIDANTIEN
UND
IHRE
WIRKUNG
AUF
FERRITIN
UND
NO
111
5.6
UV-BESTRAHLUNG
MIT
ANTIOXIDANS-VORINKUBATION
BEI
KERATINOZYTEN
UND
FIBROBLASTEN
113
5.7
VERAENDERUNGEN
IM
EISEN
UND
NO-STOFFWECHSEL
DER
HAUT
VON
AE-PATIENTEN
117
6
ZUSAMMENFASSUNG
120
7
LITERATURVERZEICHNIS
122
IV |
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