Genetik und biochemische Aspekte der enantioselektiven Amidasen aus Rhodococcus erythropolis MP50 und Agrobacterium tumefaciens d3:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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| Beschreibung: | Stuttgart, Univ., Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
5
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
13
2
MATERIAL
UND
METHODEN
19
2.1
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
19
2.2
NAEHRMEDIEN
21
2.3
MEDIENZUSAETZE
22
2.4
STAMMERHALTUNG
23
2.5
ANZUCHT
VON
BAKTERIENKULTUREN
23
2.5.1
ANZUCHT
DER
STAEMME
R
ERYTHROPOLIS
MP50,
R.
ERYTHROPOLIS
BD2.101
UND
A
TUMEFACIENS
D3
23
2.5.2
ANZUCHT
VON
E.
CO/I-STAEMMEN
24
2.6
MESSUNG
DES
BAKTERIENWACHSTUMS
24
2.7
ZELLEMTE
25
2.8
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
25
2.9
PROTEINANALYTISCHE
METHODEN
26
2.9.1
PROTEINBESTIMMUNG
26
2.9.2
BESTIMMUNG
DER
AMIDASEAKTIVITAET
26
2.9.3
PROTEINREINIGUNG
MITTELS
FPLC
27
2.9.3.1
REINIGUNG
DER
ENANTIOSELEKTIVEN
AMIDASE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
28
2.9.3.2
REINIGUNG
DER
ENANTIOSELEKTIVEN
AMIDASE
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
30
2.9.4
ULTRAFILTRATION
31
2.9.5
SDS-POLYACRYLAMIDGELEKTROPHORESE
31
2.9.6
TRYPTISCHER
VERDAU
VON
PROTEINEN
33
2.9.7
SEQUENZIERUNG
VON
PEPTIDEN
UND
AMINOTERMINI
VON
PROTEINEN
34
2.10
HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
35
2.10.1
REVERSED-PHASE
CHROMATOGRAPHIE
35
2.10.2
LONENPAARCHROMATOGRAPHIE
37
2.10.3
CHIRALE
ANALYSE
VON
ENANTIOMERENGEMISCHEN
UND
BESTIMMUNG
DER
ENANTIOMERENVERHAELTNISSE
ENZYMKATALYSIERTER
REAKTIONEN
37
2.10.4
TRENNUNG
VON
TRYPTISCHEN
PEPTIDEN
39
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.11
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
40
2.11.1
DNA-PRAEPARATIONEN
40
2.11.1.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
40
2.11.1.2
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.
COLI
41
2.11.1.3
PRAEPARATION
LINEARER
UND
ZIRKULAERER
PLASMIDE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
A.
TUMEFACIENS
D3
FUER
DIE
WECHSELFELDGELELEKTROPHORESE
42
2.11.2
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
43
2.11.3
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
43
2.11.3.1
DNA-SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
43
2.11.3.2
HERSTELLUNG
EINES
DNA-LAENGENSTANDARDS
44
2.11.3.3
ALKALISCHE
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG
44
2.11.3.4
BEHANDLUNG
MIT
T4-DNA-LIGASE
44
2.11.3.5
HERSTELLUNG
EINES
T-VEKTORS
45
2.11.3.6
SL-NUKLEASE-BEHANDLUNG
45
2.11.4
HERSTELLUNG
DIGOXIGENIN-MARKIERTER
DNA-SONDEN
45
2.11.5
DNA-GELELEKTROPHORESE
46
2.11.5.1
KONVENTIONELLE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
46
2.11.5.2
WECHSELFELDGELELEKTROPHORESE
46
2.11.6
AUFARBEITUNG
VON
DNA
47
2.11.6.1
GELELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
47
2.11.6.2
DNA-FAELLUNG
47
2.11.7
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
47
2.11.7.1
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
(YYSOUTHERN
BLOTTING
"
)
47
2.11.7.2
AUFTRAEGEN
VON
DNA-LOESUNGEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
(YYDOT
BLOTTING
"
)
48
2.11.7.3
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUS
BAKTERIENKOLONIEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
(KOLONIEHYBRIDISIERUNG)
48
2.11.8
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
MIT
DIG-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
49
2.11.9
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
DIG-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
49
2.11.10
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COZI-ZELLEN
50
2.11.11
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
50
2.11.12
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
51
2.11.13
PUNKTGERICHTETE
MUTATIONEN
IN
PLASMIDEN
51
2.11.14
DNA-SEQUENZIERUNG
52
2.12
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
55
INHALTSVERZEICHNIS
7
2.13
SCHMELZPUNKTBESTIMMUNG
56
2.14
SYNTHESE
VON
CHEMIKALIEN
56
2.14.1
DARSTELLUNG
VON
2-PHENYLPROPIONAMID
56
2.14.2
DARSTELLUNG
VON
A-METHOXYPHENYLACETAMID
56
2.14.3
DARSTELLUNG
VON
O-ACETYLMANDELAMID
57
2.14.4
DARSTELLUNG
VON
PHENYLCHLORACETAMID
57
2.14.5
DARSTELLUNG
VON
2-METHYL-3-PHENYLPROPIONAMID
57
3
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
58
3.1
DIE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
AUS
RHODOCOCCUS
ERYTHROPOLIS
MP50
58
3.1.1
HYDROLYSE
VON
UNTERSCHIEDLICH
SUBSTITUIERTEN
PHENYLACETAMIDEN
DURCH
DIE
GEREINIGTE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
58
3.1.2
HYDROLYSE
VON
IBUPROFENAMID
DURCH
DIE
GEREINIGTE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
59
3.1.3
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINZELNER
PEPTIDE
AUS
DER
ENANTIOSELEKTIVEN
AMIDASE
VON
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
60
3.1.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUER
DIE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
KODIERENDEN
GENCLUSTER
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
62
3.1.4.1
KLONIERUNG
DES
FUER
DIE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
KODIERENDEN
GENS
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
62
3.1.4.2
KLONIERUNG
EINES
WEITEREN
DNA-FRAGMENTS
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
64
3.1.4.3
NUKLEOTIDSEQUENZEN
DER
IN
DEN
PLASMIDEN
PRAML
UND
PRAM2
ENTHALTENEN
DNA-FRAGMENTE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
DARAUS
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZEN
66
3.1.4.4
DAS
AMIDASE-GEN
AMDA
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
72
3.1.4.5
DIE
OFFENEN
LESERAHMEN
ORF2,
ORF3
UND
ORF4
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
74
3.1.4.6
DIE
OFFENEN
LESERAHMEN
ORF1
UND
ORF5
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
75
3.1.5
LOKALISIERUNG
DES
AMIDASE-GENS
AMDA
IM
GENOM
VON
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
76
3.1.6
STABILITAET
DES
AMIDASE-GENS
AMDA
IM
GENOM
VON
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
78
3.1.7
EXPRESSION
DES
AMIDASE-GENS
AMDA
AUS
R
ERYTHROPOLIS
MP50INE.
COLI
83
3.2
DIE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
AUS
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
D3
86
3.2.1
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINZELNER
PEPTIDE
AUS
DER
ENANTIOSELEKTIVEN
86
AMIDASE
VON
A.
TUMEFACIENS
D3
3.2.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
FUER
DIE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
KODIERENDEN
GENCLUSTERS
AUS
A
TUMEFACIENS
D3
87
3.2.2.1
KLONIERUNG
DES
FUER
DIE
ENANTIOSELEKTIVE
AMIDASE
KODIERENDEN
GENS
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
87
8
INHALTSVERZEICHNIS
3.22.2
KLONIERUNG
EINES
WEITEREN
DNA-FRAGMENTS
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
89
3.2.2.3
NUKLEOTIDSEQUENZEN
DER
IN
DEN
PLASMIDEN
PAAML
UND
PAAM2
ENTHALTENEN
DNA-FRAGMENTE
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
UND
DARAUS
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZEN
91
3.2.2.4
DAS
AMIDASE-GEN
AMDA
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
96
3.2.2.5
DIE
OFFENEN
LESERAHMEN
ORF1-ORF8
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
98
3.2.3
LOKALISIERUNG
DES
AMIDASE-GENS
AMDA
IM
GENOM
VON
A.
TUMEFACIENS
D3
103
3.2.4
EXPRESSION
DES
AMIDASE-GENS
AMDA
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
105
3.2.5
HYDROLYSE
VON
UNTERSCHIEDLICH
SUBSTITUIERTEN
PHENYLACETAMIDEN
MIT
ROHEXTRAKT
AUS
ZELLEN
VON
E.
COLI
JM
1
09(PST2WT)
108
3.2.6
PUNKTGERICHTETE
MUTATIONEN
IM
AMIDASE-GEN
AMDA
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
109
4
DISKUSSION
114
4.1
PHYLOGENETISCHE
BEZIEHUNGEN
DER
ENANTIOSELEKTIVEN
AMIDASEN
AUS
RHODOCOCCUS
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
D3
ZU
ANDEREN
PROKARYOTISCHEN
AMIDASEN
114
4.2
DIE
DIE
AMIDASE-GENE
ENTHALTENDEN
GENCLUSTER
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
A.
TUMEFACIENS
D3
119
4.2.1
DIE
GENCLUSTER
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
120
4.2.2
DAS
GENCLUSTER
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
122
4.3
LOKALISIERUNG
DER
AMIDASE-GENE
IM
GENOM
VON
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
A.
TUMEFACIENS
D3
124
4.3.1
PLASMIDE
IN
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
4.
TUMEFACIENS
D3
124
4.3.2
NACHWEIS
DER
AMIDASE-GENE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
A.
TUMEFACIENS
D3
AUF
PLASMIDEN
125
4.3.3
STABILITAET
DES
AMIDASE-GENS
IM
GENOM
VON
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
127
4.4
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
AMIDASE-GENE
AUS
R
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
A.
TUMEFACIENS
D3
IN
E.
COLI
128
4.5
DER
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
SUBSTITUENTEN
IN
A-POSITION
ZUR
AMIDFUNKTION
IN
PHENYLACETAMIDEN
AUF
DIE
ENZYMATISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DER
ENANTIO
SELEKTIVEN
AMIDASEN
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
UND
A.
TUMEFACIENS
D3
131
4.6
ENANTIOSELEKTIVE
HYDROLYSE
VON
IBUPROFENAMID
DURCH
DIE
AMIDASE
AUS
R.
ERYTHROPOLIS
MP50
136
4.7
DER
EINFLUSS
VON
AMINOSAEUREAUSTAUSCHEN
INNERHALB
DES
YYAMIDASE
SIGNATURE
"
-
MOTIVS
AUF
DIE
ENZYMATISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DER
ENANTIOSELEKTIVEN
AMIDASE
AUS
A.
TUMEFACIENS
D3
137
5
LITERATUR
139 |
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