Untersuchungen zur Resistenz von Amaranthus spp. und Conyza canadensis (L.) Cronq. gegen verschiedene ALS-Inhibitoren:
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2000
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zur Resistenz von Amaranthus spp. und Conyza canadensis (L.) Cronq. gegen verschieden
Autor: Michel, Albrecht
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung............................................................................................1
1.1 Anwendung von Herbiziden und Herbizidresistenz..........................1
1.1.1 Definitionen......................................................................................1
1.1.2 Resistenzbildung..............................................................................2
1.1.3 Bedeutung der Herbizidresistenz.....................................................3
1.2 Resistenz gegen ALS-Inhibitoren........................................................4
1.2.1 Hemmstoffe der Acetolactatsynthase (ALS-Inhibitoren)................4
1.2.2 Die Acetolactatsynthase...................................................................5
1.2.3 Die Sequenz verschiedener ALS-Gene............................................7
1.3 Testmöglichkeiten auf genetischer Ebene.........................................11
1.3.1 Einsatz molekularer Marker...........................................................11
1.3.2 Amplifikation bestimmter Bereiche des ALS-Gens......................13
1.4 Biologie und Verbreitung der untersuchten Pflanzenarten............13
1.4.1 Amarant-Arten...............................................................................14
1.4.2 Conyza canadensis (L.) Cronquist (Kanadisches Berufkraut).......16
1.5 Zielsetzung der Arbeit........................................................................16
2 Material und Methoden................................................................18
2.1 Herkunft des Samenmaterials der verschiedenen linkrautarten... 18
2.2 Pflanzenanzucht..................................................................................20
23 Gewächshausversuche........................................................................20
2.3.1 Durchführung von Dosis-Wirkungsexperimenten.........................20
2.4 Überprüfung von Resistenzmechanismen, die nicht auf
einer Veränderung des Zielenzy ms beruhen....................................22
2.4.1 Test auf metabolische Resistenz durch
Cytochrom-P450-Monooxygenase................................................23
2.4.2 Untersuchungen zur Aufnahme, Translokation
und zum Metabolismus von l4C-Nicosulfuron..............................23
2-5 Überprüfung von Target-Site-Resistenz-Mechanismen..................24
2.5. i Extraktion von ALS aus Blanmateria!...........................................25
2.5.2 ALS-Assay.....................................................................................26
Inhaltsverzeichnis
2.6 Molekularbiologische Untersuchungen.............................................27
2.6.1 DNA-Extraktion.............................................................................28
2.6.1.1 CTAB-Extraktion (Rogers Bendich 1985)..............................29
2.6.1.2 Miniprep (Lassner et al. 1989).....................................................30
2.6.1.3 Plant-DNA-Isolation-Kit (Boehringer Mannheim)........................31
2.6.1.4 DNeasy-Plant-Mini-Kit (Qiagen, Hilden)......................................32
2.6.2 RAPD-PCR(Random-Amplified-Polymorphic-DNA)..................33
2.6.3 Reinigung, Klonierung und Sequenzierung polymorpher
Banden der RAPD-PCR.................................................................35
2.7 Amplifikation spezifischer Bereiche des ALS-Gens.........................39
2.7.1 Optimierung der PCR-Bedingungen..............................................40
2.7.2 Verwendete Primer.........................................................................41
2.7.3 Aufreinigung der PCR-Produkte....................................................42
2.7.4 Sequenzierung der Amplifikate......................................................43
2.8 Statistische Auswertung...............................................................43
3 Ergebnisse..........................................................................................45
3.1 Dosis-Wirkungsexperimente mit den verschiedenen Biotypen 45
3.1.1 Reaktion unterschiedlich empfindlicher Biotypen
von A. retroflexus auf Behandlung mit Sulfometuron....................45
3.1.2 Vergleich der empfindlichen und resistenten Biotypen
von A retroflexus...........................................................................46
3.1.3 Vergleich der Herbizidempfindlichkeit verschiedener
Biotypen von A. blitoides...............................................................48
3-1 -4 Vergleich der Herbizidempfindlichkeit verschiedener
Biotypen von A. rudis.....................................................................50
3 I 5 Vergleich der Herbizidempfindlichkeit verschiedener
Biotypen von C. canadensis...........................................................51
3.2 Test auf metabolische Resistenz verursacht durch
Cytochrom-P450-Monooxygenase......................................................53
3.3 Untersuchungen zur Aufnahme, Translokation
und zum Metabolismus von Nicosulfuron.........................................56
3-3.1 Aufnahme und Transiokation von l4C-Nicosuifuron.....................56
3.3.2 Metabolismus von 14C-Nicosulfuron..............................................57
3.4 Hemmstudien an isolierter ALS aus C. canadensis und A. rudis ....59
3.5 DNA-Extraktion...............................................................................61
Inhaltsverzeichnis
3.6 RAPD-PCR..........................................................................................64
3.7 Sequenzierung polvmorpher RAPD-PCR Fragmente.....................68
3.8 Spezifische PCR...................................................................................70
3.8.1 Spezifische Amplifikation der verschiedenen Regionen...............70
3.8.2 Basen- bzw. Aminosäuresequenz der sequenzierten Regionen.....71
3.8.2.1 Region A bzw. Region A+ der Amarant-Arten.............................71
3.8.2.2 Region A+der C. canadensis-Biotypen.........................................74
3.8.2.3 Sequenzen der Region B................................................................76
4 Diskussion...........................................................................................79
4.1 Ermittlung von Resistenzfaktoren zur Quantifizierung
des Resistenzgrades.............................................................................79
4.1.1 Anlage und Durchführung der Dosis-Wirkungsexperimente........79
4.1.2 Auswertung der Dosis-Wirkungsexperimente...............................81
4.1.3 Schlußfolgerungen.........................................................................85
4.2 Aufklärung des Resistenzmechanismus............................................86
4.2.1 ALS-Assay.....................................................................................86
4.2.2 Weitere ALS-Assays......................................................................89
4.2.3 Aufnahme und Translokation.........................................................89
4.2.4 Metaboiismus.................................................................................90
4.2.5 Zusammenfassung und Bewertung................................................92
4J Molekularbiologie...............................................................................93
4.3.1 DNA-Extraktion.............................................................................93
4.3.2 Resistenzmarker durch RAPD-PCR..............................................94
4.3.2.1 Markerselektion..............................................................................94
4.3.2.2 Lage der RAPD-Primer..................................................................96
4.3.3 PCR mit spezifischen Primern.......................................................99
4.3.4 Weitere Erkenntnisse...................................................................101
4.4 Zur Bedeutung eines genetischen Resistenztests............................102
4.5 Ausblick..............................................................................................103
5 Zusammenfassung..........................................................................103
6 SUMMARY...........................................................................................106
7 Literatur.........................................................................................109
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Srukturformeln von Vertretern verschiedener
ALS-Inhibitoren...........................................................................4
Abb. 1.2: Biosynthese der verzweigtkettigen Aminosäuren........................5
Abb. 1.3: Konservierte Bereiche (Domänen) der Aminosäure-
sequenz der ALS mit den zur Resistenz führenden
Mutationsstellen bei Pflanzen......................................................8
Abb. 1.4: Bisher identifizierte Mutationsstellen der ALS-Primär-
struktur als Ursache der ALS-Inhibitor-Resistenz
(erweitert durch Ergebnisse von Untersuchungen
an Bakterien und Hefen).............................................................11
Abb. 2.1: Karte des pPCR-Script™SK(+)-Plasmids mit den
codierenden Genbereichen und den wichtigsten
Schnittstellen, sowie der Lage der Primer T3 undT7................36
Abb. 3.1: Dosis-Wirkungsbeziehungen der empfindlichen
A. retroflexus-Biolypen (AI, A6, A7. AI 1, A12. A35)
nach Behandlung mit Sulfometuron (Oust)...............................46
Abb. 3.2: Dosis-Wirkungsbeziehungen verschiedener
A. retroflexus-Biotypen (AI, All, A4, A5)
nach Behandlung mit Sulfometuron (Oust)...............................47
Abb. 3.3: Vergleich der Empfindlichkeit von Mais (Sorte Bahia)
nach der Behandlung mit Nicosulfuron (Motiveil)
mit und ohne Zusatz von Malathion...........................................54
Abb. 3.4: Vergleich der Empfindlichkeit von C. canadensis
gegenüber Nicosulfuron mit und ohne Zusatz
von Malathion.............................................................................55
Abb. 3.5: Chromatogramme der Extrakte der verschiedenen
Pflanzenteile resistenter (R) und sensitiver (S)
Biotypen von Conyza canadensis 72 h nach
Behandlung mit 14C-Nicosulfuron über das Blatt......................58
Abb. 3.6: Hemmung der isolierten ALS von C. canadensis
durch Thifensulfuron..................................................................60
Abb. 3.7: Hemmung der isolierten ALS von A. rudis
durch Thifensulfuron................................................................61
Abb. 3.8: Mit vier verschiedenen Methoden extrahierte DNA
aus A. retroflexus......................................................................62
Abb. 3.9: Bandenmuster der verschiedenen A. retroflexus-
Biotypen nach RAPD-PCR mit Primer Roth-N03...................65
Abb. 3.10: Bandenmuster der verschiedenen A. retroflexus-
Biotypen nach RAPD-PCR mit Primer Roth-N05...................66
Abb. 3.11: Bandenmuster der verschiedenen A. retroflexus-
Biotypen nach RAPD-PCR mit Primer Roth-N14...................67
Abb. 3.12: pPCR-Script™ SK-Plasmid mit inseriertem
RAPD-Fragment N03-650 der resistenten
A. retroflexus-Biotypen............................................................68
Abb. 3.13: Sequenz des RAPD-Fragments N03-650 der resistenten
A. retroflexus-Biotypen A4 und AS nach Sequenzierung
mit den Primern T3 und T7......................................................69
Abb. 3.14: Spezifische Amplifikation der Regionen A, A+ und B
am Beispiel von A. blitoides.....................................................71
Abb. 3.15: Vergleich der Nukleotidsequenz der Region A
bzw. Region A+ der verschiedenen Amarant-Arten...........72/73
Abb. 3.16: Vergleich der Nukleotidsequenz der Region A+
eines sensitiven (C9) und eines resistenten (C4)
Biotypen von C. canadensis................................................74/75
Abb. 3.17: Vergleich der Nukleotidsequenz der Region B
der verschiedenen Biotypen der Amarant-Arten
und C. canadensis................................................................76/77
Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1: Weltweite Verbreitung herbizidresistenter Unkräuter.................3
Tab. 1.2: Übersicht über Pflanzenarten, deren ALS-Gen ganz
oder in Teilen sequenziert wurde.................................................7
Tab. 2.1: Herkunft der verschiedenen Biotypen der
getesteten Unkrautarten..............................................................19
Tab. 2.2: Verwendete Wirkstoffe mit den entsprechenden
formulierten Produkten und den verwendeten
Konzentrationsbereichen............................................................21
Tab. 3.1: Resistenzfaktoren und ED50-Werte der getesteten ALS-
Inhibitoren bei verschiedenen A. retroflexus-B iolypen..............48
Tab. 3.2: Resistenzfaktoren und ED50-Werte der getesteten ALS-
Inhibitoren bei verschiedenen A. blitoides-B iotypen.................49
Tab. 3.3: Resistenzfaktoren und ED50-Werte der getesteten ALS-
Inhibitoren bei verschiedenen A. rudis-Biotypen.......................50
Tab. 3.4: Resistenzfaktoren und ED50-Werte der getesteten ALS-
Inhibitoren bei verschiedenen C. canadensis-Biotypen.............52
Tab. 3.5: Aufnahme und Translokation von l4C-Nicosulfuron
bei Conyza canadensis 24 und 72 h nach
der Behandlung über das Blatt...................................................56
Tab. 3.6: RAPD-Primer, mit denen diagnostische Banden
zur Detektion ALS-Inhibitor resistenter Biotypen von
A. retroflexus amplifiziert wurden..............................................65
Tab. 4.1: Zusammenhang zwischen Mutationsort und Ausprägung
der ALS-Inhibitor-Resistenz......................................................84
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