In-situ-Nachweis der Auxinverteilung in kultivierten Petiolenexplantaten von transgenen Pflanzen während der Induktion der somatischen Embryogenese bei Daucus carota L.:
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Autor: Imani, Jafargholi
Jahr: 1999
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 6
2 LITERATURÜBERSICHT 10
2.1 Wachstum der höheren Pflanzen und Phytohormone 10
2.2 Überblick über Auxine 12
2.2.1 Auxintransport und Bedeutung der Auxininhibitoren 16
2.2.2 Induktion von Adventivwurzelbildung 20
2.2.3 Einfluß exogener Auxine auf endogene Indolessigsäure ( IES) 21
23 Somatische Embryogenese 22
2.3.1 Regulation der Genaktivität während der somatischen Embryogenese 26
2.3.2 Einfluß von verschiedenen Faktoren, insbesondere Auxin. auf die
Induktion der somatischen Embryogenese 28
2.4 Zellzyklussynchronisation 30
2.5 Genübertragung in Pflanzenmaterial 31
2.6 Ziele der angewandten Gentechnik 35
2.7 Aufgabenstellung 37
3 MATERIAL UND METHODEN 39
3.1 Anzucht der Pflanzen 39
3.2 Kulturbedingungen 39
3.2.1 Nährmedien 39
3.2.2 Gewinnung von Kallusmaterial aus Karottensamen 42
3.2.3 Kallus aus Weizen- und Gerstensamen 42
3.2.4 Petiolenkulturen 43
3.2.5 Hypokotylkulturen 44
3.2.6 Suspensionskulturen 44
3.2.6.1 Etablierung und Kultivierung einer Suspensionskultur 44
3.2.6.2 PCV-Bestimmumg 46
Inhaltsverzeichnis
3.2.6.3 Vitalitätstest mit Fluoresceindiacetat(FDA) 46
3.2.7 Zellzyklussynchronisation der Karottenzellsuspensionen 46
3.2.8 Verfahren zur somatischen Embryogenese 47
3.2.8.1 Somatische Embryogenese in Petiolenexplantaten 48
3.2.8.2 Somatische Embryogenese in Suspensionskulturen aus Petiolen 48
3.2.8.3 Somatische Embryogenese in Suspensionskulturen aus Samen 49
3.2.8.4 Regeneration von Pflanzen im Fermenter (Bioreaktor) 49
3.2.9 Einsatz von Antiauxin 49
3.2.9.1 Toxizität von PCIB gegenüber Karottenphloemexplantaten 50
3.2.9.2 Frischgewichtsbestimmung 50
3.2.9.3 Einfluß von PCIB auf die somatische Embryogenese 5!
3.3 Molekularbiologische und gentechnologische Methoden 51
3.3.1 Bakterienkultur 52
3.3.1.1 Medien für die Bakterienkultur 52
3.3.1.2 Bakterienstämme 53
3.3.1.3 Plasmide und Klonierungsvektoren 54
3.3.1.4 Herstellung von kompetenten Bakterienzellen 54
3.3.1.5 Transformation von kompetenten Bakterien 56
3.3.1.6 Glycerin-Einlagerung von Bakterien 56
3.3.2 Plasmid-DNS-Präparation 56
3.3.2.1 Plasmidisolierung in kleinem Maßstab (mini-prep) 56
3.3.2.2 Midi-Präparation von Plasmid-DNS 58
3.3.2.3 Plasmidisolierung in großem Maßstab (maxi-prep) 58
3.3.3 Reinigung von Plasmid-DNS 60
3.3.3.1 RNase A-Behandlung von Plasmid-Präparationen 60
3.3.3.2 Proteinase K-Behandlung 60
3.3.3.3 Phenol-Chloroform Extraktion 61
3.3.3.4 Reinigung der DNS durch CsCl-Gradienten 61
3.3.4 Isopropanolfällung 62
3.3.5 Fällung der DNS in Ethanol 62
3.3.6 Quantitative und qualitative Bestimmung des DNS-Gehaltes 62
3.3.7 Restriktionsverdau von DNS durch Endonukleasen 63
3.3.7.1 Präparativer Verdau des Plasmids pPCV720 mit Sall und BamHI 63
3.3.7.2 Präparativer Verdau des Plasmids pPCV812 mit Sall und BamHI 64
3.3.7.3 Präparativer Verdau des Plasmids pBlN35S-mGFP mit Sacl und BamHI 65
3.3.8 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 65
3.3.8.1 Auftrennung von DNS auf präparativen Gelen 66
3.3.9 Gewinnung von DNS aus präparativen Gelen 66
3.3.9.1 Isolierung von DNS-Fragmenten durch die Glasmilch-Methode 67
3.3.9.2 DNS-Elution aus Agarosegelstücken nach Koenen (1989) 68
3.3.9.3 Qiagen-Gelextraktionskit 68
Inhaltsverzeichnis III
3.3.9.4 Elektroelution von DNS 68
3.3.10 Ligation von DNS-Fragmenten 69
3.3.11 Transformation des Bakterienstamms HB101 mit dem Hybridplasmid
pPCV812/MAS/GUS 70
3.3.12 Ausplattieren transformierter Bakterien und Selektion positiver Klone 70
3.3.13 Übertragung des Plasmids in Agrobakterium tumefaciens 70
3.3.13.) Parasexualität 70
3.3.13.2 Konjugation 71
3.3.13.3 Konjugation des E. co/j-Stamms S-17-1 mit dem Agrobaaerium 71
tumefaciens Stamm GV3101 pMP90 RK 71
3.3.14 Nachweis des Binärvektors pPCV812/MAS/GUS in Agrobaaerium
tumefaciens 72
3.3.14.1 Behandlung mit Endonuclease 72
3.3.14.2 Rückkonjugation 73
3.3.15 Transformation des Pflanzenmaterials mit Agrobakterium tumefaciens 73
3.3.15.1 Transformation des Hypokotyls 73
3.3.15.2 Transformation der embryogenen Zellsuspension 74
3.3.16 Präparation genomischer DNS von Karotten 75
3.3.16.1 DNS-Isolierung mit der CTAB-Methode 76
3.3.16.2 DNS-Isolierung mit dem DNeasy Plant mini-kit von Fa. Qiagen 78
3.3.17 Spaltung genomischer DNS für das Southern-Verfahren 79
3.3.18 Nachweis der Transformation der Karottenzellkulturen 80
3.3.18.1 Molekulargenetischer Nachweis 80
3.3.18.1.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 80
3.3.18.1.2 Southern-Verfahren 81
3.3.18.2 Biochemisch-enzymatischer Nachweis 88
3.3.18.2.1 Fluorimetrischer GUS-Assay 88
3.3.18.2.2 Chemischer GUS-Assay 88
3.4 Histologische Untersuchungen 89
4 ERGEBNISSE 91
4.1 Somatiscbe Embryogenest 91
4.1.1 Somatische Embryogenese in Kallusmaterial der kultivierten
Karottensamen 94
4.2 Einsatz von Anüauxin p-Chlorophenoxyisobuttersäure (PCIB) 98
4.2.1 Toxizität von p-Chlorophenoxyisobuttersäure (PCIB)
gegenüber Karottenwurzelexplantaten 99
IV Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Einfluß der p-Chlorophenoxyisobuttersäure (PCIB) auf die Entwicklung
somatischer Embryonen 101
4.3 Fermenterkultur 105
4.4 Erstellung transgener Pflanzen, Nachweis der GUS-Aktivität
im Hypokotyl 107
4.5 Transformation von Zellsuspensionskulturen von Daucus carota 110
4.6 Biochemisch-enzj matischer Nachweis der GUS-Aktivität in
embryogenen Karottenzellsuspensionen 111
4.6.1 Fluorometrischer GUS-Nachweis in transgenen
Karottenzellsuspensionen 111
4.6.2 Nachweis der Glucuronidase-Aktivität durch X-Gluc 112
4.7 Erstellung eines transgenen Pflanzenklons 114
4.8 Molekulargenetischer Nachweis der Gene der T-DNS des
Binärvektors pPCV218 MAS/GUS im Genom der
transgenen Karottenstämme (Daucus carota L.) 116
4.8.1 Nachweis des Gens durch das PCR-Verfahren 116
4.8.2 Nachweis des Gens durch das Southern-Verfahren 118
4.9 Auxinverteilung in transgenen Pflanzenorganen 120
4.10 Auxinverteilung in kultivierten transgenen Petiolen 126
5 DISKUSSION 138
5.1 Etablierung eines effektiven Transformationsprotokolls zur
Erstellung transgener Pflanzen 138
5.2 Zellzyklussynchronisation 142
5-3 Nachweis der Integration der Gene in das Genom der Karotte 145
5.4 Somalische Embryogenese 148
5.5 Auxinverteilung in verschiedenen Organen transgener
Karottenpflanzen 154
Inhaltsverzeichnis
5.6 Endogene Auxinverteilung während der Induktion der somatischen
Embryogenese in kultivierten Petiolenexplantaten transgener
Karottenpflanzen 156
5.7 Möglichkeit und Grenzen der transgenen Pflanzen zur Aufklärung
der Rolle des Auxins in einem Entwicklungsprozeß 162
ZUSAMMENFASSUNG 164
LITERATURVERZEICHNIS 167
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 199
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