Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "advanced glycation endproducts": Implikationen für die Pathogenese der Alzheimer'schen Demenz
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| Format: | Buch |
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ZUSAMMENFASSUNG. 1
SUMMARY. 3
1. EINLEITUNG. 5
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1. MATERIAL.16
2.2. METHODEN.
1. HERSTELLUNG VON AGES.18
2. DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE ZUM NACHWEIS VON SACCHARIDEN.19
3. ENDOTOXIN-TEST. 19
4. ENTFERNEN VON ENDOTOXIN MIT POLYMYXIN B.19
5. PROTEINBESTIMMUNG. 20
6. FLUORESZENZMESSUNGEN.20
7. MESSUNG DER RADIKALPRODUKTION VON AGES DURCH
REDUKTION VON CYTCHROM C. 21
8. BESTIMMUNG DES CML GEHALTS VON AGES DURCH
KOMPETITIVEN ELISA. 21
9. INKUBATION VON SSA4 MIT ZUCKERN UND UEBERGANGSMETALL-IONEN. 21
10. EINBAU VON [^C]-ZUCKEM IN SSA4.22
11. NACHWEIS VON SSA4-AGE UND GROESSENBESTIMMUNG VON
. SSA4-01IGOMEREN DURCH FPLC. 22
12. ZELLKULTUR
12.1. HERSTELLUNG VON ZELLKULTURMEDIUM. 22
12.2. ZELLLINIEN. 23
12.3. ALLGEMEINE ZELLKULTURTECHNIKEN. 23
12.4. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL. 23
12.5. EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN. 24
13. ZYTOTOXIZITAETSTESTS
13.1. MTT-ASSAY. 24
13.2. LDH-ASSAY. 25
13.3. NEUTRALROT-ASSAY. 25
14. GLUKOSE-BESTIMMUNG MITTELS GOD-PAP-METHODE.26
15. LAKTATBESTIMMUNG.26
16. GLUTATHIONBESTIMMUNG. 27
17. ATP-MESSUNG. 27
18. NACHWEIS THIOBARBITURSAEURE-REAKTIVER SUBSTANZEN. 28
19. GELRETARDATIONSEXPERIMENTE (EMSA)
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
19.1. HERSTELLUNG VON KEMEXTRAKTEN.29
19.2. BINDUNGSREAKTION. 29
19.3. KOMPETITIONSEXPERIMENTE. 30
19.4. MARKIERUNG DER SONDE. 31
20. RNA-ISOLATION MIT TRIZOL-REAGENZ. 31
20.1 DNASE-VERDAU. 32
21. RT-PCR. 32
%
22. SDS-PAGE. 33
23. WESTEMBLOT. 36
24. DIGITONINLYSE VON ZELLEN ZUM NACHWEIS VON CYT C. 37
25. FACS-FAERBUNGEN.37
26. SONSTIGE PUFFER UND LOESUNGEN. 38
2.3. GERAETE. 39
2.4. SOFTWARE.39
3. ERGEBNISSE
1. EINFLUSS VON AGES AUF DIE VERNETZUNG VON SSA4
1.1. VERNETZUNG UND GLYKIERUNG VON SSA4.40
1.2. ABHAENGIGKEIT DER SSA4-VEMETZUNG VOM INKUBATIONSPUFFER.41
1.3. UNTERSUCHUNGEN ZU REAKTIONSMECHANISMUS UND -KINETIK DER
SSA4-VEMETZUNG DURCH EINBAU VON [^C]-ZUCKEM.42
1.4. BESCHLEUNIGUNG DER AMYLOIDVEMETZUNG DURCH UEBERGANGSMETALLE.43
1.5. AUFTRENNUNG DER SS A4-AGGREGATE UEBER FPLC.45
1.6. INHIBITION DER PEPTIDVEMETZUNG DURCH METALLCHELATOREN
UND ANTIOXIDANTIEN.46
2. ZYTOTOXIZITAET VON "ADVANCED GLYCATION ENDPRODUCTS"
2.1. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VERSCHIEDENER PROTEIN-AGES.48
2.2. DIREKTE TOXIZITAET VON AGES.51
2.2.1. TOXIZITAET VON BSA- UND OVALBUMIN-AGES.51
2.2.2. DOSIS-ZEIT-ABHAENGIGKEIT DER TOXIZITAET.53
2.2.3. ZEITVERLAUF DER AGE-BILDUNG.54
2.2.4. TOXIZITAET VON SSA4(L-40) UND SSA4-AGE.55
2.3. ABSCHWAECHUNG DER AGE-TOXIZITAET.!.57
2.3.1. ANTIOXIDANTIEN, RADIKALFANGER UND STOFFWECHSELINTERMEDIATE. 58
2.3.2. ABSCHWAECHUNG DER TOXIZITAET VON SSA4 UND SSA4-AGE
DURCH A-LIPONSAEURE.62
2.3.3. ZYTOPROTEKTION DURCH BLOCKIEREN VON RAGE.63
2.3.2.1. NACHWEIS VON RAGE (RECEPTOR OF AGES) IN SH-SY5Y ZELLEN.63
2.3.3.2. ABSCHWAECHUNG DER AGE-TOXIZITAET DURCH INKUBATION DER
ZELLEN MIT RAGE-ANTISENSE-OLIGOS. 66
2.3.3.3. ABSCHWAECHUNG DER AGE-TOXIZITAET DURCH RAGE-ANTIKOERPER.67
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.3.4. KOMBINATION VON ANTIOXIDANTIEN UND RAGE-ANTIKOERPEM. 68
2.4. TOXIZITAET VON METHYLGLYOXAL.70
2.4.1. PROTEKTION GEGEN METHYLGLYOXAL-VERMITTELTE TOXIZITAET.71
3. AKTIVIERUNG VON
NFKB DURCH AGES.73
4. NACHWEIS VON TBARS IN AGE-GESTRESSTEN ZELLEN.75
4.1. VERRINGERUNG DER BILDUNG VON TBARS DURCH ANTIOXIDANTIEN
UND ANDERE SUBSTANZEN.76
%
5.1. GLUTATHIONGEHALT VON ZELLEN UNTER AGE-STRESS. 77
5.2. VERAENDERUNGEN IM GLUTATHIONSPIEGEL BSA-AGE GESTRESSTER ZELLEN.77
5.3. VERAENDERUNGEN DES THIOLSTATUS DURCH SSA4 UND SSA4-AGE.80
5.4. WIEDERHERSTELLUNG DES THIOLSTATUS DURCH ANTIOXIDANTIEN. 80
6. UNTERSUCHUNGEN ZUR ART DES AGE-VERMITTELTEN ZELLTODS. 81
6.1. ANNEXIN-FLUORESCEIN-FAERBUNGEN. 82
6.2. FREISETZUNG VON CYTOCHROM C INS ZYTOPLASMA.85
6.3. SPALTUNG VON PARP. 86
7. UNTERSUCHUNGEN ZUM ENERGIESTATUS AGE-BEHANDELTER ZELLEN
7.1. ATP-GEHALT AGE-GESTRESSTER ZELLEN. 88
7.1.1. ATP-DEPLETION DURCH BSA-AGE. 88
7.1.2. ATP-DEPLETION DURCH SSA4 UND SSA4-AGE. 89
7.2. AENDERUNGEN IM GLUKOSEVERBRAUCH DURCH AGE-STRESS
7.2.1. EFFEKT VON BSA-AGE. 90
7.2.2. EFFEKT VON SSA4 UND SSA4-AGE. 91
7.3. LAKTATAUSSCHUETTUNG UNTER AGE-STRESS
7.3.1. EFFEKT VON BSA-AGE. 92
7.3.2. EFFEKT VON SSA4 UND SSA4-AGE. 93
7.4. ABSCHWAECHUNG DER ATP-DEPLETION UND NORMALISIERUNG
DER GLUKOSEAUFIIAHME UND LAKTATAUSSCHUETTUNG
7.4.1. EFFEKT VON (R+) A-LIPONSAEURE UND 17SS-ESTRADIOL. 94
7.4.1.2. ANDERE ANTIOXIDANTIEN UND PYRUVAT.95
7.4.2. NORMALISIERUNG DER GLUKOSEAUFIIAHME.95
7.4.3. NORMALISIERUNG DER LAKTATAUSSCHUETTUNG.96
8. UEBERBLICK.'.97
4. DISKUSSION.99
5. LITERATUR. 1 N
6. ANHANG
ABKUERZUNGEN.129
FORMELN.
131
PUBLIKATIONSLISTE.132
LEBENSLAUF.134
ERKLAERUNG.135
DANKSAGUNG. 136
III |
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