Alanyl-Aminopeptidase: molekulare Mechanismen der Gen- und Oberflächenexpression humaner T-Lymphozyten und funktionelle Konsequenzen der Hemmung ihrer enzymatischen Aktivität und Genexpression
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINFUEHRUNG.7
2 ZIELSTELLUNG.11
3 MATERIAL UND METHODEN. 14
3.1 PATIENTEN, ZELLLINIEN, PRAEPARATION MONONUKLEAERER ZELLEN UND
T-ZELL-ANREICHERUNG
SOWIE BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE.14
3.2 INHIBITOREN DER APN UND DPIV SOWIE HEMMSTOFFE DER TRANSKRIPTION,
TRANSLATION
UND GLYKOSYLIERUNG.17
3.3 RNA-ISOLATIONSMETHODEN.18
3.4 REVERSE T RANSKRIPTION.19
3.5 ENZYMATISCHE AMPLIFIKATION.20
3.6 QUANTITATIVE RT-PCR.20
3.7 YYRNASE PROTECTION ASSAY" (RPA).22
3.8 NACHWEIS VON MUTATIONEN IM APN-GEN.22
3.8.1 YYSINGLE-STRANDED CONFORMATIONAL POLYMORPHISM" (SSCP) -ANALYSE.22
3.8.2 RESTRIKTIONS-FRAGMENT-LAENGEN-POLYMORPHISMUS (RFLP) -ANALYSEN.23
3.8.2.1 DNA-PRAEPARATION UND RESTRIKTIONSVERDAUUNG.23
3.8.2.2 DNA-ELEKTROPHORESE UND SOUTHEM-TRANSFER.24
3.8.2.3 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION.24
3.8.2.4 PRAEPARATION DER DIG-MARKIERTEN APN-GEN-SONDE.25
3.8.3 SEQUENZIERUNG DER SSCP-FRAGMENTE.26
3.9 PROTEINANALYTISCHE TECHNIKEN.27
3.9.1 ZELLLYSATE UND -HOMOGENISATE.27
3.9.2 SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE UND IMMUNOBLOT.27
3.9.3 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG.28
3.9.4 DETEKTION VON IMMOBILISIERTEN PROTEINEN.28
3.9.5 ENZYMATISCHE ASSAYS.30
3.9.6 PROLIFERATIONSASSAYS.30
3.9.7 DURCHFLUSSZYTOFLUORIMETRIE.31
3.10 MESSUNG DER INTRAZELLULAEREN CALCIUMIONEN-KONZENTRATION.32
4 ERGEBNISSE.34
4.1 EXPRESSION DER ALANYL-AMINOPEPTIDASE AUF HUMANEN T-LYMPHOZYTEN SOWIE
DAVON ABGELEITETEN T-ZELLLINIEN.34
4.1.1 KONSTITUTIVE EXPRESSION DER ALANYL-AMINOPEPTIDASE IN HUMANEN
T-ZELLLINIEN.34
4.1.2 AKTIVIERUNGSABHAENGIGE INDUKTION DER ALANYL-AMINOPEPTIDASE AUF
HUMANEN
T-LYMPHOZYTEN.38
4.1.2.1 INDUKTION DER AMINOPEPTIDASE-AKTIVITAET.38
4.1.2.2 INDUKTION DER CD 13-OBERFLAECHENEXPRESSION.40
4.1.2.3 AKTIVIERUNGSABHAENGIGE ERHOEHUNG DER APN-MRNA-GEHALTE HUMANER
T-LYMPHOZYTEN.42
4.2 DER EINFLUSS VON HEMMSTOFFEN DER PROTEINBIOSYNTHESE UND DER
GLYKOSYLIERUNG
AUF DIE AKTIVIERUNGSABHAENGIGE INDUKTION DER APN-GEN- UND OBERFLAECHEN
EXPRESSION HUMANER T-LYMPHOZYTEN.44
4.3 DIE WIRKUNG DER HEMMSTOFFE DER ALANYL-AMINOPEPTIDASE PROBESTIN UND
ACTINONIN AUF DIE PROLIFERATION UND DNA-SYNTHESE VON HUMANEN LEUKOZYTEN
UND DAVON ABGELEITETEN ZELLLINIEN.50
4.4 DER EINFLUSS DER HEMMUNG DER GEN-EXPRESSION DER ALANYL-AMINOPEPTIDASE
AUF
DAS WACHSTUM HUMANER T-LYMPHOZYTEN, KARPAS-299- UND U937-ZELLEN.56
2
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.5 DER EINFLUSS DER HEMMUNG DER AKTIVITAET ODER DER GEN-EXPRESSION DER
ALANYL-
AMINOPEPTIDASE AUF DIE ZYTOKINBIOSYNTHESE HUMANER T-LYMPHOZYTEN UND
KA RP AS-299-ZELLEN.57
4.6 MODULATION DER EXPRESSION UND AKTIVITAET VON
SIGNALTRANSDUKTIONS-KOMPONENTEN
DURCH DIE AMINOPEPTIDASE-INHIBITOREN PROBESTIN UND ACTINONIN.65
4.6.1 INDUKTION DER MAP-KINASE P42/ERK2 IN KARPAS-299-ZELLEN DURCH
ACTINONIN
UND PROBESTIN.65
4.6.2 DER EINFLUSS VON PROBESTIN UND ACTINONIN AUF DIE AKTIVIERUNG VON
PL90RB UND
MEK1/2.67
4.7 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN CALCIUMONEN-KONZENTRATION.69
4.8 NACHWEIS VON MUTATIONEN IM ALANYL-AMINOPEPTIDASE-GEN BEI PATIENTEN,
DIE AN
LEUKAEMIE ODER LYMPHOM ERKRANKTEN.70
4.8.1 RESTRIKTIONS-FRAGMENT-LAENGEN-POLYMORPHISMUS (RFLP)-ANALYSEN.70
4.8.2 YYSINGLE-STRANDED CONFORMATIONAL POLYMORPHISM" (SSCP) -ANALYSE.73
5 DISKUSSION.77
5.1 BASALE UND INDUZIERTE APN-GEN- UND -OBERFLAECHENEXPRESSION HUMANER
T-LYMPHOZYTEN.77
5.2 KONSEQUENZEN DER INHIBIERUNG VON APN-EXPRESSION BZW. -AKTIVITAET.83
5.2.1 PROLIFERATION HUMANER LEUKOZYTEN.83
5.2.2 ZYTOKINPRODUKTION HUMANER LEUKOZYTEN.85
5.3 SIGNALTRANSDUKTION UEBER APN?.92
5.4 MUTATIONEN IM HUMANEN APN-GEN.96
5.5 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION.100
6 REFERENZEN.104
7 DANKSAGUNG.125
8 ANHANG.126
3 |
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