Biochemische und funktionelle Charakterisierung von Kompartimenten des Rezeptor-Recyclingweges:
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| Format: | Buch |
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2000
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| Beschreibung: | Mainz, Univ., Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.4
1.1 BEDEUTUNG DES VESIKULAEREN TRANSPORTS.4
1.2 DER TRANSFERRIN-ZYKLUS UND SEINE KOMPARTIMENTE.5
1.3 REGULATION DES VESIKULAEREN TRANSPORTS DURCH RAB-PROTEINE.8
1.4 RAB-PROTEINE IM TRANSFERRIN-ZYKLUS. 14
1.5 ZIELSETZUNG.16
2. MATERIAL UND METHODEN.18
2.1 MATERIAL.18
2.2 PROTEINANALYTISCHE METHODEN.21
2.2.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE. 21
2.2.2 PROTEINFAERBUNG MIT COOMASSIE-BLAU.23
2.2.3 WESTEM-BLOTTING.23
2.2.4 PONCEAU-S-FAERBUNG.24
2.2.5 IMMUNOCHEMISCHE ANALYSE DER MEMBRANGEBUNDENEN PROTEINE.25
2.2.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN.26
2.3 ZELLKULTUR.27
2.3.1 ALLGEMEINE BEDINGUNGEN.27
2.3.2 PASSAGIEREN DER ZELLEN.27
2.3.3 ANLEGEN, LAGERUNG UND AUFTAUEN VON DAUERKULTUREN.28
2.4 PRAEPARATION EINES POSTNUKLEAEREN UEBERSTANDES (PNS) AUS ZELLEN.28
2.5 FRAKTIONIERUNG EINES PNS DURCH ULTRAZENTRIFUGATION
IN VERSCHIEDENEN GRADIENTENSYSTEMEN.30
2.5.1 FRAKTIONIERUNG EINES PNS DURCH ULTRAZENTRIFUGATION IN EINEM
KONTINUIERLICHEN SACCHAROSEGRADIENTEN.30
2.5.2 FRAKTIONIERUNG EINES PNS DURCH ULTRAZENTRIFUGATION IN EINEM
KONTINUIERLICHEN PERCOLLGRADIENTEN.32
2.5.3 FRAKTIONIERUNG EINES PNS DURCH ULTRAZENTRIFUGATION
IN EINEM DISKONTINUIERLICHEN SACCHAROSEGRADIENTEN.33
2.6 IMMUNISOLIERUNG ENDOSOMALER MEMBRANEN.33
2.6.1 KOVALENTE KOPPLUNG VON SEKUNDAERANTIKOERPEM AN OBERFLAECHEN
AKTIVIERTE DYNABEADS.34
2.6.2 IMMUNISOLIERUNG MIT ANTI-RAB5-, ANTI-RAB 11 - ODER
ANTI-TFR-ANTIKOERPEM-GEKOPPELTEN DYNABEADS.36
2.6.3 VORBEREITENDE BEHANDLUNG DER IMMUNISOLATE FUER DIE
ELEKTRONENMIKROSKOPIE.39
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.6.4 MALDI (MATRIX-ASSISTED-LASER-DESORPTION-AND-JONIZATION-)
MASSENSPEKTROMETRIE ZUR IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN.39
2.7 INKUBATION VON ZELLEN UND PNS MIT NOCODAZOL UND TAXOL ZUR
DESTABILISIERUNG
BZW. STABILISIERUNG VON MIKROTUBULI.40
2.8 INTERNALISIERUNG DER FLUID-PHASE-MARKER MEERRETTICHPEROXIDASE
UND AVIDIN IN CHO-ZELLEN.41
2.9 DAB-POLYMERISATION ZUR SELEKTIVEN ERHOEHUNG DER
GLEICHGEWICHTSDICHTE VON ORGANELLEN (DAB-DENSITY-SHIFT).42
2.10 INTERNALISIERUNG VON BTF UND TF-HRP DURCH CHO-ZELLEN.43
2.11
IN N/W-REKONSTITUTION EINZELNER ENDOCYTOSESCHRITTE MIT
IMMUNISOLIERTEN ENDOSOMALEN MEMBRANEN.45
2.11.1 SPEZIFISCHE BINDUNG CYTOSOLISCHER PROTEINE
AN IMMUNISOLIERTE MEMBRANEN (RECRUITMENT-ASSAY).47
2.11.2 ABSCHNUERUNG VON MEMBRANVESIKELN VON ENDOSOMALEN MEMBRANEN
(BUEDDING-ASSAY).48
2.11.3
IN VITRO-ASSAY ZUR UNTERSUCHUNG VON TRANSPORT- UND
FUSIONSEREIGNISSEN ZWISCHEN ENDOSOMALEN MEMBRANEN (FUSION-ASSAY).49
2.12. NACHWEIS VON MEMBRANEN DES GOLGI-APPARATS DURCH DAS MARKERENZYM
DES //.V-GOLGI-NETZWERKS (TGN) GALACTOSYLTRANSFERASE (E.C.2.4.1.38).50
3. ERGEBNISSE.52
3.1 VERWENDETE MARKER ZUR DETEKTION VON SORTING- UND
RECYCLING-ENDOSOMEN.52
3.2 ANREICHERUNG VON SORTING- UND RECYCLING-ENDOSOMEN
DURCH PNS-FRAKTIONIERUNG IN SACCHAROSE- UND PERCOLLDICHTEGRADIENTEN.53
3.2.1 VERTEILUNG VON SORTING- UND RECYCLING-ENDOSOMEN
IN KONTINUIERLICHEN SACCHAROSE- UND PERCOLLGRADIENTEN.54
3.2.2 VERTEILUNG VON SORTING- UND RECYCLING-ENDOSOMEN IN
KONTINUIERLICHEN
SACCHAROSEGRADIENTEN UNTER MIKROTUBULI-STABILISIERENDEN ODER
-DESTABILISIERENDEN BEDINGUNGEN.57
3.3 MODIFIKATION DER DICHTE VON ENDOSOMEN DURCH LUMINALE POLYMERISATION
VON DIAMINOBENZIDIN (DAB).58
3.4 ISOLIERUNG VON SORTING-ENDOSOMEN UND RECYCLING-ENDOSOMEN DURCH
EINE KOMBINATION VON DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION UND
IMMUNISOLIERUNG.63
3.4.1 ANREICHERUNG VON SORTING- UND RECYCLING-ENDOSOMEN DURCH
ULTRAZENTRIFUGATION IN EINEM DISKONTINUIERLICHEN SACCHAROSEGRADIENTEN.66
3.4.2 ERGEBNISSE DER IMMUNISOLIERUNGEN.70
3.4.2.1 IMMUNISOLIERUNG VON TFR-ASSOZIIERTEN MEMBRANEN.70
3.4.2.2 IMMUNISOLIERUNG VON RAB5-ASSOZIIERTEN MEMBRANEN.71
3.4.2.3 IMMUNISOLIERUNG VON RABL I-ASSOZIIERTEN MEMBRANEN.72
3.4.2.4 ANREICHERUNG VON RAB5, RABL 1, TFR UND GALACTOSYLTRANSFERASE
DURCH DIE
KOMBINATION VON DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION UND IMMUNISOLIERUNG.73
3.4.3 TRANSPORT VON ENDOCYTOTISCH AUFGENOMMENEM TRANSFERRIN
DURCH RAB5- UND RABL 1-POSITIVE KOMPARTIMENTE.76
2
3.4.4 MORPHOLOGIE DER MIT ANTI-RAB5-, ANTI-RABL I- ODER
ANTI-TFR-ANTIKOERPEM ISOLIERTEN MEMBRANEN.78
3.4.5 IDENTIFIZIERUNG VON MIT RAB5- ODER RABL 1-POSITIVEN MEMBRANEN
ASSOZIIERTEN PROTEINEN.80
3.4.5.1 IDENTIFIZIERUNG VON ANGEREICHERTEN PROTEINEN MIT MALDI-MS
(MATRIX-ASSISTED-LASER-DESORPTION-LONIZATION-MASS-SPECTROMETRY).81
3.4.5.2 DETEKTION VON SYNTAXIN 13 IN DEN MIT ANTI-RAB5- UND
ANTI-RABL 1-ANTIKOERPERN ISOLIERTEN MEMBRANEN.87
3.4.5.3 MIT ANTI-RAB5- UND ANTI-RABL 1-ANTIKOERPERN ISOLIERTE ENDOSOMALE
MEMBRANEN UNTERSCHEIDEN SICH IN IHRER AFFINITAET FUER EEA1.88
3.5 VERWENDUNG DER MIT ANTI-RAB5- UND ANTI-RABL 1-ANTIKOERPERN
IMMUNISOLIERTEN
MEMBRANEN ZUR REKONSTITUTION ENDOCYTOTISCHER TRANSPORTSCHRITTE.91
3.5.1 REKONSTITUTION DER HOMOTYPISCHEN FUSION VON RABL 1-POSITIVEN
RECYCLING-
ENDOSOMEN SOWIE DES TRANSPORTS VON SORTING- ZU RECYCLING-ENDOSOMEN.92
3.5.2 REKONSTITUTION DER VESIKELABLOESUNG VON RECYCLING-ENDOSOMEN
(BUEDDING-ASSAY).96
4. DISKUSSION.99
4.1 ISOPYKNISCHE ZENTRIFUGATION DES PNS UND ANWENDUNG DER DAB-REAKTION
ZUR CHARAKTERISIERUNG VON SORTING- UND RECYCLING-ENDOSOMEN.100
4.2 DIE KOMBINATION VON DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION UND
IMMUNISOLIERUNG
MIT ANTIKOERPERN GEGEN RAB5 UND RABL 1 FUEHRT ZUR ISOLIERUNG ZWEIER
UNTERSCHIEDLICHER ENDOSOMENPOPULATIONEN. 102
4.3 DIE IMMUNISOLIERTEN RAB5- UND RABL 1-POSITIVEN ENDOSOMEN
WERDEN SEQUENTIELL VON TRANSFERRIN DURCHLAUFEN. 105
4.4 DIE IMMUNISOLIERTEN RAB5- UND RABL I-POSITIVEN ENDOSOMEN
UNTERSCHEIDEN SICH IN IHRER PROTEINKOMPOSITION. 107
4.5 FOLGERUNGEN AUS DER LOKALISATION VON RAB5, RAB4 UND RABL 1 IM
HINBLICK
AUF DIE VON IHNEN REGULIERTEN TRANSPORTSCHRITTE. 113
4.6 BEWERTUNG DER ERSTEN CHARAKTERISIERUNG DER
IN VITRO-ASSAYS.116
4.7 ORGANISATION DES ENDOCYTOTISCHEN RECYCLINGWEGES UND FUNKTION
DES RECYCLING-ENDOSOMS.120
5. ZUSAMMENFASSUNG.122
6. LITERATURVERZEICHNIS.124
7. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.138
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