Klonierung und Charakterisierung von genomischen und cDNA-Klonen, die für den neuronalen nikotinischen Acetylcholinrezeptor von Heliothis virescens kodieren:
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1999
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Beschreibung: | Mainz, Univ., Diss., 2000 |
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INHALTSVERZEICHNIS
L
INHALT
ABKUERZUNGEN VI
1 EINLEITUNG 1
1.1 REIZWEITERLEITUNG IM NERVENSYSTEM 1
1.2 NACHREN IN DER NEUROMUSKULAEREN ENDPLATTE 2
1.3 NACHEN IN NEURO-NEURONALEN SYNAPSEN 3
1.4 NACHREN IN INSEKTEN 5
1.5 WARUM NEUE INSEKTIZIDE? 7
1.6 PROBLEMSTELLUNG UND ZIELE DER ARBEIT 8
2 MATERIAL UND METHODEN 11
2.1 MATERIAL UND GERAETE 11
2.1.1 PLASTIKWAREN 11
2.1.2 CHEMIKALIEN UND ANDERE REAGENZIEN 11
2.1.3 ENZYME 12
2.1.4 MEMBRANMATERIALIEN UND GELFILTERATIONSMATERIALIEN 12
2.1.5 RADIOAKTIVE MATERIALIEN 12
2.1.6 HAEUFIG VERWENDETE PUFFER UND LOESUNGEN 12
2.1.7 KULTURMEDIEN 13
2.1.8 VEKTOREN 14
2.1.9 BAKTERIENSTAEMME 14
2.1.10 HERSTELLUNG KOMPETENTER
E.COLI BAKTERIENZELLEN 15
2.1.11 GERAETE 15
2.1.12 VERSUCHSTIERE 15
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 17
2.2.1 LAMBDA-MINIGENBIBLIOTHEK 17
2.2.1.1 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS
H. VIRESCENS 17
2.2.1.2 FRAKTIONIERUNG DER GENOMISCHEN DNA 17
2.2.1.3 KLONIERUNG IN LAMBDAPHAGEN-ARME 18
2.2.1.4 KONSTRUKTION DER GENOMISCHEN X-BANK 19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS II
2.2.1.5 AUFFIILLREAKTION UND LIGATION DES VEKTORS UND GENOMISCHEN DNA 19
2.2.1.6
IN VITRO VERPACKEN DER LIGATION 20
2.2.1.7 DURCHMUSTERUNG DER GENOMISCHEN BIBLIOTHEK 20
2.3
ERZEUGUNG EXONUKLEOLYTISCHER DELETIONSKLONE 21
2.3.1 RESTRIKTION DER DNA 21
2.3.2 PARTIELL EXONUKLEOLYTISCHER VERDAU 21
2.3.3 KLONIERUNG DER DELETIERTEN DNA 22
2.4 HERSTELLUNG DER CDNA-BIBLIOTHEK 22
2.4.1 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA 22
2.4.2
PRAEPARATION VON POLYA+-RNA 23
2.4.3 CDNA-ERSTSTRANG-SYNTHESE 24
2.5 AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS PCR 25
2.5.1 KLONIERUNG DER PCR-PRODUKTE 26
2.6 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 26
2.6.1 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA 26
2.6.2 MAXIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA 27
2.6.3 PRAEPARATION VON AE.-DNA 27
2.7 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEURE 28
2.7.1 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA 28
2.7.1.1 AGAROSEGELE 28
2.7.1.2 DENATURIENDE POLYACRYLAMIDGELE (SEQUENZIERGELE) 29
2.7.2 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA 30
2.8 SEQUENZIERUNG DOPPEBTAENGIGER PLASMID- DNA 31
2.8.1 SEQUENZANALYSE 31
2.9 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA DURCH YYRANDOM LABELLING**
31
2.10 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 32
2.10.1 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 32
2.10.2 DEPHOSPHORYLIERUNG MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 32
2.10.3 ERZEUGUNG STUMPFER DNA-ENDEN 32
2.10.4 DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 33
2.10.4.1 QN
+-EXTRAKTION 33
2.10.4.2 DNA-EXTRAKTION VON QUIAGEN 34
2.10.5 LIGATION 34
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.10.6 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN 34
2.10.7 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 35
2.11 TRANSFER UND HYBRIDISIERUNG VON NUKLEINSSUREN 35
2.11.1
SOUTHERN-B\OX 35
2.11.2 NORTHERN- BLOT 36
2.12 DIGOXIGENIN-MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN (YY3-END-LABELLING") 36
2.12.1 UEBERPRUEFUNG DER DIDOXYGENIN-MARKIERUNG MITTELS YYDOT-BLOT" 37
2.13 HISTOLOGISCHE METHODEN 38
2.13.1 HERSTELLUNG VON GEFRIERSCHNITTEN 38
2.13.1.1 SILANISIERUNG VON OBJEKTTRAEGERN 38
2.13.1.2 SCHNEIDEN AM GEFRIERMIKROTOM 38
2.13.1.3 HAEMATOXYLIN/EOSIN (HE)-FAERBUNG 38
2.14 IN
SITU HYBRIDISIERUNG 39
2.14.1 IN
SITU HYBRIDISIERUNG AN KOPFGEFRIERSCHNITTEN 40
3. ERGEBNISSE 41
3.1 GENOMANALYSE VOV
H. VIRESCENS MITTELS OCI S/A-SPEZIFISCHER PROBEN 41
3.2 HERSTELLUNG EINER AE.-MINIGENBIBLIOTHEK 43
3.2.1 HERSTELLUNG EINER LAMBDA-GENBIBLIOTHEK 44
3.2.2 DURCHMUSTERUNG DER MINI-GENBIBLIOTHEK 45
3.3 CHARAKTERISIERUNG DER GENOMISCHEN X-KLONE 46
3.4 CHARAKTERISIERUNG DER SUBKLONE 48
3.4.1 RESTRIKTIONSKARTIERUNG UND HYBRIDISIERUNG MIT DEM PROBE 1 48
3.4.2 SUBKLONIERUNG DER GENOMISCHEN RESTRIKTIONSFRAGMENTE 48
3.4.3 ERZEUGUNG EXONUKLEOLYTISCHER DELETIONSKLONE 51
3.5 SEQUENZIERUNG UND SEQUENZANALYSE DER GENOMISCHEN KLONE 54
3.5.1 SEQUENZIERUNG 54
3.5.2 SEQUENZEN 54
3.5.3 SEQUENZANALYSE 55
3.6 KOMPLEMENTIERUNG DER NACHR-GENFRAGMENTE AUS
H. VIRESCENS 56
3.6.1 VERVOLLSTAENDIGUNG DER HL-SEQUENZ AM 5' UND 3'-ENDE 56
3.6.2 SUBKLONIERUNG DER GENOMISCHEN PSTL TEILFRAGMENTE VON KLON HL 57
3.7 VERVOLLSTAENDIGUNG DES KLONS H3 AM 5* UND 3'-ENDE 60
3.8 SEQUENZEN UND SEQUENZANALYSE 61
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.9 KONSTRUKTION EINER GENOMISCHEN X-BANK VON
H. VIRESCENS 63
3.10 LIGATION UND KONTROLLLIGATION DES VEKTORS (X-GEM 12) UND DER 67
GENOMISCHEN DNA AUS
H. VIRESCENS
3.11 OPTIMIERUNG DER MOLAREN VERHAELTNISSES VON VEKTOR ZU GENOMISCHER 69
DNA IN DEN LIGATIONEN
3.12 BESTIMMUNG EINES GEEIGNETEN N^STAMIUES UND ^OPTIMIERUNG DER 69
INFEKTION
3.13 ERSTELLUNG EINER GENOMISCHEN X-BANK AUS
H. VIRESCENS 70
(ENVACHSENENSTADIUM)
3.13.1 DURCHMUSTERUNG DER GENOMISCHEN X-BANK 70
3.13.2 CHARAKTERISIERUNG DER ISOLIERTEN GENOMISCHEN X-KLONE 71
3.13.2.1 RESTRIKTIONSANALYSE 71
3.13.2.2 SUBKLONIERUNG DER GENOMISCHEN RESTRIKTIONSFRAGMENTE 74
3.14 SEQUENZIERUNG UND SEQUENZANALYSE DER GENOMISCHEN KLON H6 75
3.14.1 SEQUENZIERUNG 75
3.15 EXPRESSIONSANALYSE DER UNTEREINHEITEN DES NACHR (HAI UND HA3) 75
3.15.1 HERSTELLUNG EINZELSTRAENGIGER CDNA 75
3.15.2 PCR 77
3.15.3 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES PCR-PRODUKTEN 77
3.16 SCREENING DER CDNA-BIBLIOTHEK 79
3.16.1 ISOLIERUNG DER NACHR-CDNA-KLONE 80
3.16.2 SEQUENZIERUNG DER CDNA-KLONE 82
3.16.3 SEQUENZANALYSE 85
3.17 DAS PHYLOGENETISCHE STAMMBAUM DER NACHR-FAMHIE DER INSEKTEN 87
3.18 EXON-INTRON STRUKTUR DER SEQUENZIERTEN GEN UND GENFRAGMENTE 88
3.19 HYDROPHATHIEANALYSEN DER A-UNTEREINHEITEN VON INSEKTEN 89
3.20
IN SITE-HYBRIDISIERUNG IM VIERTEN UND FUENFTEN LARVENSTADIUM 90
VON
H. VIRESCENS
3.20.1 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER EINGESETZTEN SONDEN 93
3.20.2 NACHWEIS DER AL UND A3-NACHR-MRNA DURCH IN SITU HYBRIDISIERUNG 93
(ISH) AN GEHIRNGEFRIERSCHNITTEN DER VIERTEN UND FUENFTEN LARVENSTADIEN
3.21 SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER EXPRIMENTE UND DER ISOLIERTEN KLONE 98
4 DISKUSSION 99
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.1 GENOMANALYSE VON
H. VIRESCENS DURCH HYBRIDISIERUNGEN MIT EINER 101
LOCUSTA
SPEZIFISCHEN PROBEN
4.1.1 ISOLIERUNG DER NACHR-GENE AUS DER MINI-GEN-BIBLIOTHEK UND
GEN-BIBLIOTHEK 101
4.1.2 GENOMISCHEN STRUKTUR DER NACHR AUS
H. VIRESCENS IM VERGLEICH MIT 102
ANDEREN NACHREN
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER AUS DER CDNA-BIBLIOTHEK ISOLIERTEN GENE 104
4.3 HOMOLOGIEVERGLEICH DER AMINOSIURESEQUENZEN DER NACHR- 105
UNTEREINHEITEN VON
H. VIRESCENS
4.3.1 HOMOLOGIEVERGLEICH DER AMINOSAEURESEQUENZEN INNERHALB DER ACH- 105
BINDUNGSNISCHE DES HAI UND DER HA3-UNTEREINHEIT MIT ANDEREN
NACHR-SEQUENZ
4.3.2 HOMOLOGIEVERGLEICH DER AMINOSAEURESEQUENZEN ALLER ISOLIERTEN KLONE
108
UNTEREINANDER UND MIT DEM GENOMISCHEN KLON AUS LOCUSTA- MIGRATORIA
(PROBE 1)
4.4 VERGLEICH DER HYDROPHATHIE DER A-UNTEREINHEITEN DES NACHRS VON 112
H. VIRESCENS
MIT ENTSPRECHENDEN UNTEREINHEITEN AUS ANDEREN INSEKTEN
4.5 POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATION IM HAI UND HA3-GENE: POTENTIELLE 112
GLYKOSILIERUNGS- UND PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
4.6 EXPRESSIONSANALYSE UND
IN ./-HYBRIDISIERUNG VON A- UND SS- 114
UNTEREINHEITEN DES NACHRS VON
H.VIRESCENS IM LARVEN- UND ENVACHSENEN-
STADIUM
4.7 AUSBLICK 115
5 ZUSAMMENFASSUNG 116
6 LITERATURVERZEICHNIS 119
7 ANHANNG 132 |
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