Identifizierung EBNA2-assoziierter Proteine in EBV-infizierten B-Lymphozyten:
Gespeichert in:
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2000
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I
NHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
ZUSAMMENFASSUNG
2
1.
EINLEITUNG
4
1.1
D
IE
F
AMILIE
DER
H
ERPESVIREN
4
1.2
D
AS
E
PSTEIN
-B
ARR
V
IRUS
(EBV)
5
1.3
EBV
ASSOZIIERTE
E
RKRANKUNGEN
7
1.3.1
INFEKTIOESE
MONONUKLEOSE
(IM)
9
1.3.2
X-IINKED
PROLIFERATIVE
SYNDROME
(XLPS)
10
1,3.3
BURKITT-LYMPHOM
(BL)
10
1.3.4
NASOPHARYNX-KARZINOM
(NPC)
11
1.3.5
HODGKIN-LYMPHOM
(HODGKIN'S
DISEASE,
HD)
11
1.3.6
IMMUNOBLASTISCHE
B-ZELL-LYMPHOME
(BLPD)
12
1.3.7
IMMUNOBLASTISCHE
T-ZELL-LYMPHOME
(TLPD)
12
1.4
G
ENOMISCHER
A
UFBAU
VON
EBV
12
1.5
R
EPLIKATIONSZYKLUS
VON
EBV
UND
BETEILIGTE
VIRALE
P
ROTEINE
14
1.5.1
LYTISCHER
ZYKLUS
14
1.5.2
LATENTER
ZYKLUS
UND
IMMORTALISIERUNG
15
1.6
F
UNKTION
VON
EBNA2
19
I
NHALTSVERZEICHNIS
2.
MATERIAL
23
2.1
Z
ELLEN
23
2.1.1
BAKTERIENSTAEMME
23
2.1.2
HEFESTAEMME
'
23
2.1.3
INSEKTENZELLEN
24
2.1.4
SAEUGERZELLEN
24
2.2
VIREN
25
2.2.1
BAKTERIOPHAGEN
25
2.2.2
BACULOVIREN
25
2.2.3
EBV
25
2.3
A
NTIKOERPER
26
2.4
N
UKLEINSAEUREN
27
2.4.1
OLIGONUKLEOTIDE
27
2.4.2
VEKTOREN
28
2.4.3
REKOMBINANTE
PLASMIDE
UND
BACS
29
2.5
E
NZYME
UND
R
EAGENZIEN
31
2.6
G
ROEBEN
-
UND
M
OLEKULARGEWICHTSMARKER
31
2.7
C
HEMIKALIEN
UND
V
ERBRAUCHSMATERIAL
31
2.8
C
OMPUTERPROGRAMME
UND
D
ATENBANKEN
32
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.
METHODEN
33
3.1
B
AKTERIEN
33
3.1.1
KULTURBEDINGUNGEN
UND
LAGERUNG
33
3.1.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
NACH
DER
RUBIDIUMCHLORID-METHODE
34
3.1.3
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
DURCH
ELEKTROPORATION
35
3.2
HEFE
36
3.2.1
KULTURBEDINGUNGEN
UND
LAGERUNG
36
3.2.2
TRANSFORMATION
VON
HEFEN
37
3.2.3
PRAEPARATION
VON
HEFE-PROTEINEXTRAKTEN
37
3.2.4
TWO-HYBRID-SYSTEM
38
3.2.4.1
GENBANKTRANSFORMATION
38
3.2.4.2
GALAKTOSIDASETEST
38
3.2.4.3
PLASMIDKURIERUNG
39
3.2.4.4
PLASMIDISOLIERUNG
UND
TRANSFER
IN
E.
COLI
39
3.2.5
LUMINOMETRISCHE
QUANTIFIZIERUNG
DER
SS-GALACTOSIDASE-EXPRESSION
39
3.3
I
NSEKTENZELLEN
40
3.3.1
KULTURBEDINGUNGEN
UND
LAGERUNG
40
3.3.2
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
41
3.3.3
INFEKTION
VON
INSEKTENZELLEN
MIT
BACULOVIREN
42
3.4
SAEUGERZELLEN
42
3.4.1
KULTURBEDINGUNGEN
UND
LAGERUNG
42
3.4.2
TRANSFEKTION
VON
SAEUGERZELLEN
44
3.4.3
IMMUNFLUORESZENZ
45
3.5
DNA-T
ECHNIKEN
46
3.5.1
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
46
3.5.2
PRAEPARATION.
REINIGUNG
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
46
3.5.2.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
46
3.5.2.2
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
HUMANEM
VOLLBLUT
48
3.5.2.3
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
48
3.5.2.4
PRAEPARATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
49
3.5.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
50
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.5.4
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
-
50
3.5.4.1
STANDARD
PCR-ANSATZ
50
3.5.4.2
EINFUEHREN
VON
MUTATIONEN
DURCH
PCR
51
3.5.5
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
51
3.5.5.1
SPALTEN
VON
DNA
DURCH
RESTNKTIONSENZYME
51
3.5.5.2
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
51
3.5.5
3
IDENTIFIKATION
REKOMBINANTER
KLONE
52
3.5.5.4
DNA-SEQUENZIERUNG
52
3.5.5.5
KLONIERUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
52
3.6
RNA-TECHNIKEN
53
3.6.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
SAEUGERZELLEN
53
3.6.2
NORTHERN
BLOT
54
3.7
P
ROTEIN
-T
ECHNIKEN
:56
3.7.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DURCH
IN
VITRO
TRANSKRIPTION/TRANSLATION
56
3.7.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
B-ZELLEN
IN
VIVO
56
3.7.3
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
IN
E.
COLI
56
3.7.4
PROTEINFAELLUNG
59
3.7.5
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
59
3.7.6
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
59
3.7.7
FAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
60
3.7.8
WESTERN
BLOT
60
3.7.9
IMMUNPRAEZIPITATION
62
3.7.10
IN
VIVO
METHYLIERUNGS-ASSAY
63
3.7.11
IN
VITRO
METHYLIERUNGS-ASSAY
64
3.7.12
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERUNGS-ASSAY
65
3.8
L
UCIFERASE
-A
SSAY
ZUR
QUANTITATIVEN
B
ESTIMMUNG
DER
P
ROMOTORAKTIVITAET
65
3.9
H
ERSTELLUNG
POLY
-
UND
MONOKLONALER
A
NTIKOERPER
66
3.10
H
ERSTELLUNG
REKOMBINANTER
E
PSTEIN
-B
ARR
V
IREN
67
3.10.1
REKOMBINATION
IN
E.
COLI
67
3.10.2
VIRUSPROPAGIERUNG
IN
293-ZELLEN
70
3.10.3
INDUKTION
DER
VIRUSPRODUKTION
UND
GEWINNUNG
INFEKTIOESER
PARTIKEL
71
3.10.4
INFEKTION
PRIMAERER
B-ZELLEN
71
I
NHALTSVERZEICHNIS
4.
ERGEBNISSE
73
4.1
LOENTFIZERUNG
EBNA2-ASSOZHERTER
PROTENE
MTT
HAFE
DES
THO-HYBRID-SYSTEMS
73
4.1.1
TEST
AUF
EIGENAKTIVIERUNG
74
4.1.2
DURCHMUSTERN
EINER
B-ZELL
GENBANK
MIT
EBNA2
76
4.2
N
ORTHERN
B
LOT
-A
NALYSEN
VON
EBNA2-I
NTERAKTK
NSPARTNERN
80
4.3
C
HARAKTERISIERUNG
DER
A
RGININ
-M
ETHYLTRANSFERASE
HRMT1L1
81
4.3.1
DNA-SEQUENZ
UND
PRIMAERSTRUKTUR
VON
HRMT1L1
81
4.3.2
EXPRESSION
VON
HRMT
1
L1
IN
UNTERSCHIEDLICHEN
ZELLINIEN
82
4.4
P
OLY
-
UND
MONOKLONALE
A
NTIKOERPER
GEGEN
HRMT1L1
83
4.4.1
BAKTERIELLE
EXPRESSION
VON
HRMT1L1
83
4.4.2
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
HRMT
1
L1
85
4.4.3
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
HRMT
1L1
86
4.5
HRMT1L1
BINDET
EBNA2
IN
WVO
UEBER
DIE
SH3-DOMAENE
88
4.5.1
BINDUNGSSTUDIEN
IN
HEFE
88
4.5.2
BINDUNGSSTUDIEN
IN
INSEKTENZELLEN
90
4.5.3
BINDUNGSSTUDIEN
IN
SAEUGERZELLEN
91
4.6
S
TUDIEN
ZUR
POSTTRANSLATIONALEN
M
ODIFIZIERUNG
VON
EBNA2
93
4.6.1
EBNA2
WIRD
IN
VIVO
IN
EBV-POSITIVEN
B-LYMPHOZYTEN
METHYLIERT
93
4.6.2
EBNA2
WIRD
IN
VITRO
SPEZIFISCH
INNERHALB
DER
RG-REGION
METHYLIERT
95
4.6.3
EBNA2
WIRD
IN
VITRO
DURCH
CASEIN-KINASE
II
PHOSPHORYLIERT
96
4.7
I
NTRAZELLULAERE
L
OKALISATION
VON
HRMT1L1
97
4.7.1
IMMUNFLUORESZENZ-STUDIEN
MIT
TRANSFIZIERTEM
HRMT1L1
97
4.7.2
IMMUNFLUORESZENZ-STUDIEN
MIT
ENDOGENEM
HRMT1L1
98
4.8
HRMT1L1
-P
ROMOTOR
-S
TUDIEN
99
4.8.1
ISOLIERUNG
UND
KLONIERUNG
DES
HRMT1L1-PROMOTORS
99
4.8.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
AKTIVIERUNG
DES
HRMT1L1-PROMOTORS
DURCH
EBNA2
101
4.9
D
IE
B
EDEUTUNG
DER
M
ETHYLIERUNG
DER
RG-R
EGION
FUER
DIE
IMMORTALISIERENDE
EIGENSCHAFT
VON
EBNA2
103
4.9.1
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
EPSTEIN-BARR
VIREN
104
4.9.2
INFEKTION
PRIMAERER
B-LYMPHOZYTEN
MIT
REKOMBINANTEN
EPSTEIN-BARR
VIREN
108
I
NHALTSVERZEICHNIS
5.
DISKUSSION
110
5.1
D
IE
B
EDEUTUNG
DER
D
OMAENE
3
VON
EBNA2
FUER
DIE
I
MMORTALISIERUNG
110
5.2
M
IT
EBNA2
INTERAGIERENDE
P
ROTEINE
110
5.3
D
IE
HUMANE
A
RGININ
-M
ETHYLTRANSFERASE
HRMT1L1
116
5.4
.
UE
BER
DIE
B
EDEUTUNG
POSTTRANSLATIONALER
A
RGININ
-M
ETHYLIERUNG
.
119
5.5
UE
BER
DIE
B
EDEUTUNG
DER
M
ETHYLIERUNG
VON
EBNA2
122
5.6
A
USBUCK
123
6.
LITERATURVERZEICHNIS
124
VEROEFFENTLICHUNGEN
140
DANKSAGUNG
141
ANHANG
A
142
ANHANG
B
143
ANHANG
C
144 |
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