Charakterisierung nidoviraler Helikasen:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG 1
1.1 NIDOVIREN.1
1.1.1 TAXONOMIE UND MORPHOLOGIE 1
1.1.2 REPLIKATION UND GENEXPRESSION VON NIDOVIREN 3
1.1.3 AUFBAU DES NIDOVIRALEN REPLIKASEGENS S
1.2 HELIKASEN.8
1.2.1 FUNKTIONAL UND EIGENSCHAFTEN VON HELIKASEN 8
1.2.2 STRUKTURANALYSEN VON HELIKASEN 10
1.2.3 HELIKASEN POSITIVSTRAENGIGER RNA-VIREN _ 13
1.2.4 NIDOVIRALE HELIKASEN 17
1.3 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT.21
2
MATERIAL 22
2.1 ANTIKOERPER.22
2.2 BAKTERIENSTAEMME.22
2.3 CHEMIKALIEN.22
2.4 DNA-LAENGENSTANDARDS.23
2.5 ENZYME.23
2.6 GERAETE.24
2.7 INSEKTENZELLEN .24
2.8 LOESUNGEN.25
2.9 MEDIOI UND MEDIENZUSAETZE FUER DIE ZELLKULTUR.28
2.10 MEDIEN FUER DIE BAKTERIENKULTUR.29
2.11 OLIGONUKLEOTIDE.29
2.12 PLASMID-DNA. 31
2.13 RADIOCHEMIKALIEN.32
2.14 SONSTIGE NUKLEINSAEUREN.32
2.15 WEITERE MATERIALIEN.32
3
METHODEN 33
3.1 BAKTERIENKULTUR.33
3.2 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER
E. COLI.33
3.3 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA.34
3.3.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN MASSSTAB 34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/961575298
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB DURCH
CHROMATOGRAFIE MIT SAEULEN DER FIRMA QIAGEN, HILDEN 34
3.4 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN.34
3.5 REINIGUNG VON DNA.35
3.5.1 REINIGUNG VON DNA MIT HILFE VON DIATOMEEN 35
3.5.2 REINIGUNG VON DNA DURCH PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION UND
ETHANOLPRAEZIPITATION 35
3.5.3 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN MIT HILFE
VON DIATOMEEN 35
3.6 MODIFIZIERUNG VON DNA-ENDEN.35
3.6.1 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DN A-ENDEN 3 5
3.6.2 PHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 36
3.6.3 GLAETTEN VON DNA-ENDEN MIT T4-DNA-POLYNRASE 36
3.7 LIGATION.36
3.8 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.37
3.9 SEQUENZIERUNG MIT HILFE DER AMPLITAQ-DNA- POLYMERASE FS.37
3.10 PCR.37
3.11 /-V/VO-REKOMBINATIONS-PCR.38
3.12 ARBEITEN MIT BACULOVIREN.39
3.12.1 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON 5/9-UND HIGH-FIVE
YY
-ZELLEN 39
3.12.2 ZELLKULTUR 39
3.12.3 TRANSFEKTION 39
3.12.4 PLAQUETEST 40
3.12.5 IDENTIFIKATION REKOMBINANTER VIREN DURCH PCR 40
3.12.6 PROTEIN-EXPRESSION UND REINIGUNG 40
3.12.7 SPALTUNG MIT ENTEROKINASE 41
3.13 EXPRESSION IN
E. COLI UND REINIGUNG REKOMBINANTER FUSIONSPROTEINE.41
3.14 GELELEKTROPHORESE.
V.42
3.14.1 AGAROSEGELE 42
3.14.2 SDS-POLYACIYLAMIDGELE ZUR AUFTRENNUNG VON PROTEINEN 43
3.14.3 NICHTDENATURIERENDE POLYACIYLAMIDGELE 44
3.15 WESTERN BLOT.44
3.15.1 SEMI-DRY-BLOT 44
3.15.2 IMMUNFAERBUNG 45
3.16 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN.45
3.17 ANALYSE DER ADENOSINTRIPHOSPHATASEAKTIVITAET.45
3.18 ANALYSE DER HELIKASEAKTIVITAET.46
3.18.1 7N-VI7RO-TRANSKRIPTION 46
INHALTSVERZEICHNIS
3.18.2 HERSTELLUNG VON PARTIELL DOPPELSTRFINGIGEN NUKLEINSAEURESUBSTRATEN
46
3.18.3 INKUBATION MIT REKOMBINANTEN, GEREINIGTEN HELIKASEN 46
4
ERGEBNISSE
47
4.1 EXPRESSION DER PUTATIVEN HELIKASE VON HCOV-229E, POEOE
YY
1, SOWIE
EINES KONTROLLPROTEINS MITTELS REKOMBINANTER BACULOVIREN.47
4.1.1 AUSWAHL DES EXPRESSIONSSYSTEMS UND KLONIERUNGSSTRATEGIE 4 7
4.1.2 KONSTRUKTION DA- PLASMIDE PBLUEBACHIS2B-HEL UND
PBLUEBACHIS2B-HEL-KA 49
4.1.3 ERZEUGUNG DER REKOMBINANTEN BACULOVIREN VBAC-HEL
UND VBAC-HEL-KA 5
1
4.1.4 ANALYSE DER EXPRESSION VON HEL UND HEL-KA 53
4.1.5 REINIGUNG VON HEL UND HEL-KA DURCH AFFINLTAETSCHROMATOGRAFIE 5S
4.2 EXPRESSION DER PUTATIVEN HELIKASE VON EAV, NSPLO, SOWIE EINES
KONTROLLPROTEINS ALS MBP-FUSIONSPROTEINE IN
E. COLI.56
4.2.1 ALLGEMEINES ZUR EXPRESSION VON MBP-FUSIONSPROTEINEN IN
E. COLI 56
4.2.2 AUFBAU DER PLAMIDEPMAL-NSPLO UNDPMAL-NSPLO-KQ 58
4.2.3 EXPRESSION UND REINIGUNG VON MBP-NSPLO UND MBP-NSPLO-KQ 58
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER ATPASE-AKTIVITAETEN VON HEL UND MBP-NSPLO.60
4.3.1 NACHWEIS DER ATPASE-AKTIVITAETEN VON HEL UND MBP-NSPLO 60
4.3.2 STIMULATION DER ATPASE-AKTIVITAETEN VON HEL UND
MBP-NSP 10 DURCH NUKLEINSAEUREN 62
4.3.3 ANALYSE DES EINFLUSSES MONOVALENTER IONEN AUF DIE
ATPASE-AEKTIVITAET VON MBP-NSPLO 64
4.4 CHARAKTERISIERUNG DER HELIKASEAKTIVITAETEN VON HEL
UND MBP-NSPLO.66
4.4.1 BESCHREIBUNG DES ZUR ANALYSE DER HELIKASEAKTIVITAETEN
ANGEWENDETEN TESTSYSTEMS 66
4.4.2 RNA-HELIKASEAKTIVITAET VON HEL 66
4.4.3 RNA-HELIKASEAKTIVITAET VON MBP-NSP 10 71
4.4.4 DNA-HELIKASEAKTIVITAETEN VON HEL UND MBP-NSPLO 73
4.4.5 EINFLUSS DER LAENGEN DER 5'-EINZELSTRAENGIGEN ENDEN VON
DNA-SUBSTRATEN AUF DIE HELIKASEAKTIVITAET VON HEL 78
4.4.6 EINFLUSS DER NUKLEOTIDSEQUENZEN DER 5'-EINZELSTRAENGIGEN ENDEN
VON DNA-SUBSTRATEN AUF DIE HELIKASEAKTIVITAET VON HEL 80
INHALTSVERZEICHNIS
4.5 CHARAKTERISIERUNG DER PUTATIV METALLBINDENDEN DOMAENEN
VON POEOE
11 UND NSPLO.82
4.5.1 MUTAGENESE DER METALLBINDENDEN DOMAENE VON POEOE
11
IM .-CO/Z-EXPRESSIONSVEKTOR PMAL-C2 83
4.5.2 MUTAGENESE DER METALLBINDENDEN DOMAENE VON NSPLO
IM E. -CO/I-EXPRESSIONSVEKTOR PMAL-C2, 85
4.5.3 EXPRESSION UND REINIGUNG VON MBP-HEL- UND MBP-NSP 10-
FUSIONSPROTEINEN MIT SPEZIFISCHEN AMINOSAEURESUBSTITUTIONEN 87
4.5.4 ATPASE-AKTIVITAETEN DER MBP-HEL- UND MBP-NSPLO-PROTEINE
MIT SPEZIFISCHEN AMINOSAEURESUBSTITUTIONEN 89
4.5.5 HELIKASEAKTIVITAETEN DER MBP-NSPLO-PROTEINE MIT
SPEZIFISCHEN AMINOSAEURESUBSTITUTIONEN 92
5
DISKUSSION
95
5.1 REKOMBINANTE EXPRESSION DER PUTATIVEN HELIKASEN P66
HEL VON
HCOV-229E UND NSPLO VON EAV.96
5.2 POLYNUKLEOTID-ABHAENGIGKEIT DER ATPASE-AKTIVITAETEN VON
HEL UND MBP-NSPLO.98
5.3 RNA-HELIKASEAKTIVITAETEN DER REKOMBINANTEN P66
HEL- UND
NSPLO-PROTEINE.100
5.4 ENTWINDUNG VON DNA-SUBSTRATEN DURCH NIDOVIRALE HELIKASEN.101
5.5 EINFLUSS DER PUTATIV METALLBINDENDEN DOMAENE AUF DIE ENZYMATISCHEN
AKTIVITAETEN VON POEOE*^ UND NSPLO.102
5.6 VERGLEICH DER PDTATIV METALLBINDENDEN DOMAENEN VON P66
HEL UND NSPLO.106
5.7 AUSBLICK.107
6
ZUSAMMENFASSUNG 111
7
SUMMARY 113
8
LITERATURVERZEICHNIS 114
9
ABKUERZUNGEN 129
10
VEROEFFENTLICHUNGEN 133
11
LEBENSLAUF 134 |
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