Produktion und Oligosaccharidanalyse des klinisch relevanten anti-CD4 monoklonalen Antikörpers MAX16H5:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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Düsseldorf
VDI-Verl.
2000
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| Schriftenreihe: | Verein Deutscher Ingenieure: [Fortschrittberichte VDI / 17]
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und Symbole VIII
1 Zusammenfassung 1
2 Stand des Wissens 3
2.1 Die Bedeutung von monoklonalen Antikörpern 3
2.2 Der murine anti human CD4 Antikörper MAX16H5 6
2.3 Monoklonale Antikörper sind Glykoproteine 8
2.3.1 N gekoppelte Glykanstrukturen 8
2.3.2 O gekoppelte Glykanstrukturen 9
2.3.3 Humane Serumantikörper 10
2.3.4 Fc und Fab Glykosylierung und deren Funktion 11
2.4 Beeinflussung der Glykosylierung durch Prozessparameter 12
2.5 Glykosylierungsanalytik für Glykoproteine 13
2.5.1 Die FACE™ Technologie Glykanprofil und Sequenzierung von
N Glykanen 14
3 Problemstellung 16
4 Material und Methoden 17
4.1 Material 17
4.2 Zellkulturmedien 17
4.3 Zellkultur 19
4.3.1 HFBR Kultur 19
4.3.2 CELLine™ Kultur 21
4.3.3 Herstellung des deglykosylierten Antikörpers MAX16H5 21
4.4 Zellkulturanalytik 22
4.4.1 Zellzählung und Vitalitätsfärbung 22
4.4.2 Quantitative Bestimmung der Stoffwechselparameter 22
4.5 Antikörperreinigung 22
4.5.1 Reinigung des MAX16H5 im Pilotmaßstab 23
4.5.2 Reinigung des MAX16H5 im Labormaßstab 24
4.5.3 Dialyse 24
4.6 Antikörperfragmentierung 24
4.6.1 Fab und Fc Fragmentierung durch Papainspaltung 24
4.6.2 Proteolytischer Verdau des mAk durch Trypsin 25
4.7 Proteinanalytik 25
4.7.1 Bestimmung des Antikörperisotyps 25
4.7.2 Quantitative Bestimmung von Gesamtprotein mit UV/VIS Spektroskopie ...25
4.7.3 Quantitative Bestimmung der Antikörperkonzentration mit ELISA 26
4.7.4 Bestimmung der spezifischen Aktivität des mAk MAX16H5 26
VI
4.7.5 SDS PAGE 27
4.7.6 Westernblot und immunchemische Detektion 28
4.8 Glykosylierungsanalytik 29
4.8.1 Glykanisolierung 29
4.8.2 Sialinsäureabspaltung 30
4.8.3 Entsalzung der Proben 31
4.8.4 Fluoreszenzmarkierung 31
4.8.5 Lectinblot 32
4.8.6 Monosaccharidanalyse mit HPAEC PAD 33
4.8.7 N Glykanprofil mit FACE™ Analyse 33
4.8.8 Sequenzierung der Oligosaccharidstrukturen mit FACE™ Analyse 34
4.8.9 Bestimmung des Sialylierungsgrades mit der HPAEC PAD 35
4.8.10AnionaustauschChromatografiemitGlycoSepC™ Säule 35
4.8.11 Affinitätschromatografie mit Aleuria aurantia Lectin 35
4.8.12 Bio Gel P 4 Gelchromatografie 36
4.8.13 MALDI TOF MS Analyse 36
5 Ergebnisse 37
5.1 Antikörperproduktion und Aufarbeitung 37
5.1.1 Produktion im HFBR mit FKS 37
5.1.2 Produktion im HFBR mit proteinfreiem Medium 39
5.1.3 Aufarbeitung im Pilotmaßstab 40
5.1.4 Produktion mit variablen Kohlenstoffquellen 41
5.1.5 Produktion von deglykosyliertem Antikörper MAX16H5 45
5.2 Charakterisierung des Referenzstandards MAX16H5 mAk 47
5.2.1 Papainspaltung 47
5.2.2 Lectinblot 48
5.2.3 Monosaccharidanalyse mit HPAEC PAD 48
5.2.4 Sialinsäurebestimmung 49
5.2.5 Glykanprofil mit FACE™ 49
5.2.6 Sequenzierung der Oligosaccharidhauptstrukturen mit FACE™ 51
5.2.7 Bestimmung des Sialylierungsgrades mittels HPAEC PAD 54
5.2.8 Bestimmung des Sialylierungsgrades mit GlycoSepC™ Analyse 55
5.2.9 Affinitätschromatografie mit Aleuria aurantia Lectin 55
5.2.10 Bio Gel P 4 Gelchromatografie und MALDI TOF MS Analyse der mittels
AAL Chromatografie separierten Strukturen 56
5.3 Antikörperglykosylierung bei verändertem Produktionsprozess 63
5.3.1 Serumhaltige und proteinfreie Suspensions und Hochzelldichtekulturen ..63
5 3.2 Variable Kohlenstoffquellen im Medium 69
5.4 Biologischer Einfluss des MAX16H5 in vitro 71
VII
5.4.1 Spezifische Bindung an das CD4 Antigen 71
5.4.2 In vitro Stabilität gegen Proteaseverdau 71
6 Fehlerbetrachtung 74
6.1 Fehler in der Zellkultur 74
6.2 Fehler in der Analytik 75
6.2.1 Proteinanalytik 75
6.2.2 Glykananalytik 75
6.2.3 FACE™ Analytik Richtlinien 76
7 Diskussion 78
7.1 Antikörperproduktion und reinigung 78
7.1.1 Produktion des mAk im HFBR 78
7.1.2 Kulturmedien 80
7.1.3 Produktreinigung 81
7.1.4 Produktion mit variablen Kohlenstoffquellen 81
7.2 Charakterisierung des MAX16H5 mAk Referenzstandard 82
7.2.1 Glykosylierung 82
7.3 Vergleich der Glykosylierung bei veränderten Prozessbedingungen 87
7.3.1 Serumhaltige und freie Suspensions und Hohlfaserbioreaktorkulturen ...87
7.3.2 Variable Kohlenstoffquellen 90
7.4 Biologischer Einfluss des MAX16H5 mAk in vitro 90
8 Ausblick 92
9 Anhang 94
10 Literaturverzeichnis 99
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