Untersuchungen zur Chemie, Isomerisierung und Farbe des Retinalchromophors in Bacteriorhodopsinmutanten:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2000
|
Schlagworte: | |
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Beschreibung: | VI, 195 S. Ill., graph. Darst. |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
_
4
2.1
HALOB
ACTERIUM
SALINARUM
UND
SEINE
RETINALPROTEINE
.
4
2.2
B
ACTERIORHODOPSIN
.
4
2.2.1
STRUKTUR
.
4
2.2.2
PHOTOZYKLUS
.
6
2.2.3
PROTONENTRANSPORT
.
7
2.2.4
RETINALBINDUNGSTASCHE
.
8
2.2.5
CHROMOPHOR
.
9
2.3
BR-K216A.
.10
2.3.1
DER
CHROMOPHOR
.
10
2.3.2
DIE
13-CIS-MTLL-TRANS-ISOMERASEAKTIVITAET
VON
BR-K216A
.11
2.4
Z
IELSETZUNG
.
12
3
ERGEBNISSE
_
14
3.1
K
ONSTRUKTION
DER
MUTATIONSTRAGENDEN
V
EKTOREN
.
14
3.2
E
RKENNUNG
UND
N
ACHWEIS
DER
EINGEFUEHRTEN
M
UTATIONEN
IN
H.
SALINARUM
.
16
3.3
P
ROTEINISOLIERUNG
.
17
3.4
S
OUTHERN
B
LOT
.
18
3.5
M
ASSENSPEKTREN
DER
BR-K216A
MUTANTEN
.
20
3.6
UV-VIS-SPEKTREN
DER
BR-K216A-MUTANTEN
.
24
3.7
R
ETI
NALSAETTIGUNG
DER
BR-K216A-MUTANTEN
.
26
3.8
B
ESTIMMUNG
DES
E
XTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
VON
BR-K216A
.
28
3.9
B
ESTIMMUNG
DER
A
USBEUTE
AN
BR-K2
1
6A.
.
30
3.10
RETINALEXTRAKTION
DER
K216A-MUTANTEN
.
30
3.10.1
RETINOL,
ANHYDRORETINOL
UND
DIE
ABSORPTIONSMAXIMA
IN
BR-K216A
.
33
3.10.1.1
DIE
ABSORPTIONSMAXIMA
VON
BR-K2
1
6A
.
33
3.11
R
EKONSTITUTION
VON
BR
-K216A
APOMEMBRANMIT
ALL
-
TRANS
-R
EHNAL
.
37
3.12
RETINAL1SOMERENVERHAELNISSE
IN
BR-K216A-MUTANTEN
.
38
3.12.1
BESTIMMUNG
DER
EXTINKTIONSKOFFUIENTEN
DER
RETINALISOMEREN
.
38
3.12.2
DUNKELISOLIERT
.
38
3.12.3
LICHTADAPTIERT
.
39
3.13
SAEURE-BASE-TITRATION
DER
BR-K216A-MUTANTEN
.
42
3.13.1
AUSWERTUNG
DER
SAEURE-BASE-TITRATION
DERBR-K216A-MUTANTEN
.
45
3.14
R
EAKTION
MIT
H
YDROXYLAMIN
.
47
3.15
B
ILDUNG
EINER
S
CHIFFSCHEN
B
ASE
MIT
E
THYLAMIN
.
52
N
3.16
AUSWERTUNG
UND
DISKUSSION
DER
ETHYLAMIN
UND
HYDROXYLAMINREAKTION
.
54
3.16.1
REAKTION,
MECHANISMUS
UND
AUSWERTUNGSGRUNDLAGE
.
54
3.16.2
DISKUSSION
DER
GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN
.
56
3.17
S
AEURE
-B
ASE
-T
ITRATIONEN
DERBR
-K216A-E
T
SB-M
UTANTEN
.
59
3.17.1
UV-VIS-SPEKTREN
DERSAEURE-BASE-TITRATIONEN
.
59
3.17.2
BESCHREIBUNG
DER
UV-VIS-SPEKTREN
.
63
3.17.3
VERGLEICH
DER
ETSB-KOMPLEXE
DERBR-K216A-ETSB-MUTANTEN
.
66
3.18
A
USWERTUNG
DER
S
AEURE
-B
ASE
-T
ITRATION
DER
BR-K216A-E
T
SB-M
UTANTEN
.
67
3.18.1
VERGLEICH
MIT
BR-WT
UND
DER
JEWEILIGEN
EINFACHMUTANTE
.
67
3.18.1.1
BR-K216A-ETSB
.
67
3.18.1.2
BR-S141AK216A-ETSB
.
.-.
.
71
3.18.1.3
BR-T89V.K2
1
6A-ETSB
.72
3.18.1.4
BR-Y
1
85F.K2
1
6A-ETSB
.
73
3.18.1.5
BR-D85N,K216A-ETSB
.
75
3.18.1.6
BR-D85E,K216A-ETSB
.
76
3.18.2
ZUSAMMENFASSENDER
VERGLEICH
.
77
3.19
DISKUSSION
DER
ABSORPTIONSMAXIMA
ODER
DER
FARBE
.
79
3.19.1
GRUNDLAGEN
.
79
3.19.2
K216
.
82
3.19.3
S141
.
83
3.19.4
T89
.
84
3.19.5
Y185
.
86
3.19.6D85
.
89
3.19.7
ZUSAMMENFASSUNG.
.
92
3.20
R
EDUKTION
MIT
N
ATRIUMBORANAT
.
92
3.21
NMR-SPEKTROSKOP1EMITBR-K216A
.
92
3.22
D
ISKUSSION
EINER
MOEGLICHEN
P
ROTONIERUNG
DER
RETINALISCHEN
C
ARBONYLGRUPPE
IN
BR-K216A
.93
3.23
R
ETINALAUSTAUSCH
ZWISCHEN
BR-K216A
UND
BR
WT
-A
POMEMBRAN
.
96
3.24
D
IE
13
CIS
-
ALL
-
TRANS
-I
SOMERISIERUNG
IN
BR-K216A
.
97
3.24.1.1
REKONSTITUTION
DER
BR-K216A-APOMEMBRANEN
MIT
13-CIS-RETINAL
.
97
3.24.1.2
CHEMISCHE
UND
THERMISCHE
STABILITAET
DER
RETINALISOMEREN
.99
3.24.1.3
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
ISOMERISIERUNG
VON
1
3-CIR
ZU
ALL-LRANR-RETINAL
IN
DEN
BR-K2
1
6A-MUTANTEN
.99
3.25
A
USWERTUNG
DER
13
CIS
-
ALL
-
TRANS
-I
SOMERISIERUNQIN
BR-K216A
.
101
3.25.1
GRUNDLAGEN
.
101
3.25.2
DISKUSSION
DER
I3-CIS-4ALL-TRANS-ISOMERISIERUNG
.
103
3.25.3
ZUSAMMENFASSUNG.
.
107
3.26
BR-S141A
.
108
3.26.1
DISKUSSION
VON
BR-S141A
.
109
3.27BR-T89V
.
111
3.27.1
DISKUSSION VON
BR-T89V.
.
113
4
DISKUSSION
.115
4.1
V
ERGLEICH
VON
BR-K216A
MIT
DER
R
EKONSTITUTION
VON
BR
WT
-A
POMEMBRAN
MIT
ALL
-
TRANS
R
ETINAL
.
115
4.2
M
ODELLE
ZUR
B
ILDUNG
VON
R
ETINOL
UND
A
NHYDRORETINOL
.
117
4.3
DAS
ABSORFTIONSMAXIMUM
VON
BR
EINMAL
ANDERS
BELEUCHTET
.
119
4.4
D
IE
13
CIS
-
ALL
-
TRANS
-I
SOMERISIERUNG
IM
P
HOTOZYKLUS
VON
BR
WT
.
122
4.5
V
ERGLEICH
DER
HALOARCHAEALEN
R
ETINALBINDUNGSTASCHEN
.
124
4.6
Z
USAMMENFASSUNG
.
129
5
MATERIAL
UND
MF-THIMW.N,,
.
.
.
IM
5.1
M
ATERIAL
.
130
5.1.1
ZENTRIFUGEN
.130
5.1.2
HPLC-APPARATUR
UND
-BEDINGUNGEN
.
130
5.1.3
CHEMIKALIEN
.130
5.1.4
ENZYME
UND
REAKTIONSPUFFER.
.
131
5.1.4.1
DNA-POLYMERASEN
.
131
5.1.4.2
DNA-RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
131
5.1.5
NAEHRMEDIEN
.
131
5.1.5.1
NAEHRMEDIEN
FUER
ESCHERICHIA
COLI
.
131
5.1.5.2
ANTIBIOTIKA
FUER
E.
COLI
.
132
5.1.5.3
NAEHRMEDIEN
FUER
HALOBACTERIUM
SALINARUM
.
133
5.1.5.4
ANTIBIOTIKUM
FUER
HALOBACTERIUM
SALINARUM
.
133
5.1.6
STAEMME
DER
VERWENDETEN
ORGANISMEN
.134
5.1.6.1
ESCHERICHIA
CO/I-STAEMME:
.
134
5.1.6.2
HALOBACTERIUM
SAUENARUM-STINUM:
.
134
5.1.7
PLASMIDE
.
135
5.1.8
OLIGONUKLEOTIDE
.
135
5.
1
.8.1
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
GEZIELTE
BR-MUTAGENESE
.
135
5.1.8.2
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
SEQUENZIENINGSREAKTION
.
136
5.1.8.3
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
AMPLIFIKATION
VON
GENEN
UND
GENFRAGMENTEN
MITTELS
PCR
.
136
5.2
M
IKROBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
137
5.2.1
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI.
.
137
5.2.2
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
VON
HALOBACTERIUM
SALINARUM
.
137
5.3
M
OLBKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
138
5.3.1
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
138
5.3.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
140
5.3.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
141
5.3.4
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
141
5.3.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
ZUR
ORTSSPEZIFISCHEN
MUTAGENESE
.
142
5.3.6
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
DNA
.
143
IV
5.3.7
DEPHOSPHORYLIERUNG
DES
LINEARISIERTEN
VEKTORS
(PUS-MEV)
.
144
5.3.8
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
145
5.3.9
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
COLI-ZELLEN
.
146
5.3.10
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
146
5.3.11
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.
COLI
.
147
5.3.12
MIDIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E
.COLI
.
147
5.3.13
ANALYTISCHE
RESTRIKTION
DER
MINI
ODER
MIDIPRAEPARATION
.
148
5.3.14
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMIDEN
UND
DNA-FRAGMENTEN
.
148
5.3.15
TRANSFORMATION
VON
HALOBACTERIUM
SALINARUM
SNOB
.
149
5.3.16
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
HALOBACTERIUM
SALINARUM
.
151
5.3.17
AMPLIFIZIERUNG
DES
BOP-GENS
AUS
GENOMISCHER
DNA
VON
H.
SALINARUM
.
.
152
5.3.18
SOUTHEM-BLOT
UND
HYBRIDISIERUNG.153
5.3.19
DETEKTION
DIGOXIGENINMARKIERTER
DNA
.
156
5.3.20
KONSTRUKTION
DIGOXIGENIN-MARKIERTER
DNA-SONDEN
.
157
5.4
BIOCHEMISCHE,
CHEMISCHE
UND
BIOPHYSIKALISCHE
METHODEN
.
158
5.4.1
IMMUNOLOGISCHE
IDENTIFIZIERUNG
VON
TRANSFORMANTEN
.
158
5.4.2
ISOLIERUNG
DER
GELBEN
MEMRANEN
DER
BR-K216A-MUTANTEN
.
159
5.4.3
NATRIUMDODCEYLSULFAT-POFYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
160
5.4.4
WESTERN-BLOT
.
162
5.4.5
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
DES
BACTERIORHODOPSINS
AUF
DER
WESTEM-BLOT-MEMBRAN
.163
5.4.6
HERSTELLUNG
VON
APOMEMBRAN
DER
BR-K2
1
6A
-MUTANTEN
.
163
5.4.7
SAETTIGUNGSGRAD
DER
GELBEN
MEMBRANEN
AN
ALL-TRANS-RETINAL
.
164
5.4.8
LICHTADAPTION
.
164
5.4.9
SAEURE-BASE-TITRATION
.
165
5.4.10
REAKTION
VON
SUBSTITUIERTEM
BR-K216A
MIT
HYDROXYLAMIN
.
165
5.4.11
REAKTION
VON
SUBSTITUIERTEM
BR-K216A
MITETHYLAMIN
.
166
5.4.12
REDUKTION
MIT
NATRIUMBORANAT
.
166
5.4.13
RETINALEXTRAKTION
AUS
BACTERIORHODOPSIN
.
167
5.4.14
REKONSTITUTION
DER
BR-K216A-APOMEMBRANEN
MIT
13-CIS-RETINAL
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ISOMERISIERUNGSGESCHWINDIGKEIT
.
167
5.4.15
THERMISCHE
STABILITAET
DER
RETINALISOMEREN
.
168
5.5
MASSENSPEKTROMETRIE
.
168
5.6
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
.
169
5.6.1
UV-VIS-SPEKTROSKOPIE
.
169
5.6.1.1
AUFNAHME
DER
UV-VIS-SPEKTREN
.
169
5.6.1.2
VERARBEITUNG
DER
UV-VIS-SPEKTREN
.
170
5.6.1.3
BESTIMMUNG
DES
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
VON
BR-K216A
.
172
5.6.1.4
BESTIMMUNG
DER
EXTINKTIONSKOEFFIZIENTEN
DER
RETINALISOMEREN
.
172
5.6.2
CP/MAS-NMR-SPEKTROSKOPIE
-----------------------------------------------------------------------------------------
173
V
5.7
E
LEKTRONISCHE
D
ATENVERARBEITUNG
.
174
5.7.1
COMPUTERPROGRAMME.
.174
5.7.2
GRAPHISCHE
DARSTELLUNG
VON
PROTEINSTRUKTUREN
.
174
5.8
F
EHLERRECHNUNG
.
175
5.8.1
LINEARE
REGRESSION
.
175
5.8.2
FEHLERRECHNUNG
DER
13-CIS-MILL-TRANS-LSOMERISIERUNG
.
176
5.8.3
FEHLERRECHNUNG
DER
HYDROXYLAMINREAKTION
.
176
5.8.4
FEHLERRECHNUNG
DER
ETHYLAMINREAKTION
.
176
5.8.5
FEHLERRECHNUNG
JUR
DIE
HALBWERTSZEIT
.
177
5.8.6
FEHLERBETRACHTUNG
DERABSORPTIONSMAXIMA
.
177
5.8.7
FEHLERRECHNUNG
JUER
DIE
AKTIVIERUNGSSENTHALPIEN
UND
-ENTROPIEN
.
177
5.8.8
FEHLERECHNUNG
JUR
DIE
FREIEN
AKTIVIERUNGSENTHALPIEN
.
177
5.8.9
FEHLERRECHNUNG
FUER
DIE
ARRHENIUSPARAMETER.
.
178
6
LITERATUR
_
179
7
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
_
188
8
^LFIH^LFLG
.190
8.1
R
EAKTION
DER
BR-K2
1
6A-M
UTANTBN
MIT
H
YDROXYLAMIN
.
190
9
DANKSAGUNG
193
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LEBENSLAUF
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