Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere:
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG. 1
LA. KATIONENTRANSPORT IN DER NIERE
.
1
L.B. OCTI-TRANSPORTER.
.
4
L.C.
HOMOLOGIE-KLONIERUNG.
. 5
L.D.
DIE XENOPUSLAEVIS OOZYTE ALS EXPRESSIONSSYSTEM.
.
6
L.E.
MESSUNGEN MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN SUBSTRATEN. 7
1.
F. ZIELSETZUNG DER ARBEIT.
.
8
2. MATERIAL UND METHODEN._._._;. 9
2. A. MATERIAL.
.
9
2.A.I. CHEMIKALIEN. 9
2.A.2. RADIOCHEMIKALIEN. 11
2.A.3. ENZYME. 12
2.A.4. KIT-SYSTEME. 12
2.A.5.
ARBEITSMATENALEN.
12
2.A.6. GERAETE. 13
2.A.7. BAKTERIENSTAEMME. 14
2.A.8. PLASMIDE. 14
2.A.9. OLIGONUKLEOTIDE. 16
2.B. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.
.
17
2.B. 1. BAKTERIENANZUCHTMEDIEN. 17
2 B.2. BAKTERIENKULTUREN. 20
2.B.3. HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN. 21
2.B.4. ELEKTROTRANSFORMATION VON E.COLI. 21
2. C. DURCHMUSTERUNG VON CDNA-BIBLIOTHEKEN.
.
22
1. C.
1. AE,GTLO-CDNA-BIBUEOTHEK. 22
2. C.2. HERSTELLUNG UND AUSPLATTIEREN VON INFEKTIONSANSAETZEN. 22
2.C.3. TITERBESTIMMUNG VON CDNA-BIBLIOTHEKEN. 23
2.C.4. DNA-TRANSFER AUF NITROZELLULOSEMEMBRANEN. 24
2.C.5. HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION VON POSITIVEN SIGNALEN. 25
2.C.6. VEREINZELUNG POSITIVER SIGNALE. 27
2.C.7. AMPLIFIZIERUNG DES BAKTERIOPHAGEN X. 28
2.D. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.
.
29
2.D. 1. HERSTELLUNG EINER RADIOAKTIVEN DNA-SONDE. 29
2.D.2. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA. 29
2.D.3. REINIGUNG VON PLASMID-DNA. 31
2.D.4. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON X-DNA. 34
2.D.5. MODIFIKATION VON DNA. 36
2.D.6. DNA-ANALYSE.:. 37
2.D.7. DNA-SEQUENZIERUNG. 37
2.D.8. CRNA-SYNTHESE. 38
2.D.9. AGAROSEGELELEKTROPHORESE DENATURIERTER RNA. 39
2.D. 10. KLONIERUNG VON ROATL. 40
2.E. MESSUNGEN AM OOZYTENSYSTEM.
.
41
2.E.I. ALLGEMEINES. 41
2.E.2. OOZYTEN-KULTURMEDIEN. 43
2.E.3. HALTUNG UND KRANKHEITEN VON XENQPUS LAEVIS. 44
2.E.4. ENTNAHME UND PRAEPARATION VON OOZYTEN. 46
2.E.5. LAGERUNG UND UMGANG MIT OOZYTEN. 49
2.E.6. MIKROINJEKTION IN OOZYTEN. 52
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.E.7. TRANSPORTMESSUNGEN AN OOZYTEN. 53
2.E.7.A. BESTIMMUNG DER SUBSTRATAUFNAHME. 53
2.E.7.B. #C-WERT-BESTIMMUNGEN. 54
2.E.7.C. /OO-WERT-BESTIMMUNGEN. 54
2.E.7.D. EFFLUX-MESSIMGEN. 55
2.E.8. ELEKTROPHYSIOLOGIE. 55
2. E.9. DATENAUSWERTUNG. 56
3. ERGEBNISSE. 57
3.A KLONIERUNG VONTOCT2.
. 57
3.B. TRANSPORTMESSUNGEN MIT VERSCHIEDENEN SUBSTRATEN.
. 59
3.C. ZEIT ABHAENGIGKEIT DES TEA-TRANSPORTS. 60
3.D. K
M- WERT-BESTIMMUNGEN. 61
3 .D. 1. TEA-KINETIK. 61
3. D.2. CHOLIN-KINETIK. 62
3.D.3. GUANIDIN-KINETIK. 64
3 .D.4. AFFINITAETEN UND MAXIMALE TRANSPORTRATEN. 65
3.E. BESTIMMUNG DER POTENTIALABHAENGIGKEIT. 67
3 .E. 1. POTENTIALABHAENGIGE K^-WERT-VERSCHIDJUNGEN. 67
3.E.2. BESTIMMUNG DER SUBSTRATAUFNAHME UNTER DEPOLARISIERENDEN BE
DINGUNGEN. 68
3.F. INHIBITION DES TEA-TRANSPORTS. 70
3 .F. 1. OLGANISCHE KATIONEN. 70
3.F.2. ORGANISCHE ANIONEN. 75
3.F.3. CORTICOSTERON. 78
3.G. KINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRANSPORTHEMMUNG DURCH
TRANSPORTIERTE UND NICHT TRANSPORTIERTE KATIONEN.
. 79
3. H. TRANS-EFFEKTE VERSCHIEDENER KATIONEN AUF MPP-A UFNAHME UND -
EFFLUX. 85
3 .H. 1. BESTIMMUNG DES MEMBRANPOTENTIALS. 85
3.H.2. MPP-AUFNAHME. 86
3. H.3. MPP-EFFLUX. 87
4. DISKUSSION. 90
4.
A. DIEOCT-FAMILIE. 90
4.B. KLONIERUNG UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VONROCT2.
. 93
4. B.I. POTENTIALABHAENGIGKEIT. 94
4.A.2. PH-ABHAENGIGKEIT.'. 95
4.C. VERGLEICHENDE FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON
ROCTL UNDROCT2.
. 96
4.C. 1. POLYSPEZIFITAET. 96
4.C.2. INHIBITOREN. 98
4.D. AUSBLICK. 104
5. ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY.^. 107
6. LITERATURVERZEICHNIS. 109
7. ANHANG. 124
7.A. PH-ABHAENGIGKEIT DES DURCH ROCT2 VERMITTELTEN
KATIONENTRANSPORTS.
. 124
7.B. PLASMIDKARTEN VON
ROCTL, ROCT2 UND ROATL. 126
7.C. STRUKTURFORMELN.
. 127
7.D. ABKUERZUNGEN UND EINHEITEN.
. 129
7.E. QUELLENTABELLE ZUM OCT-STAMMBAUM.
. 132
8. VEROEFFENTLICHUNGEN. 134
9. CURRICULUM VITAE. 135 |
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