Regulation des anabolen Metabolismus normaler und früharthrotischer Chondrozyten im humanen Gelenkknorpel:
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INHALT
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
3
2.1
D
ER
K
NORPEL
IN
DER
F
ETALENTWICKLUNG
3
2.2
P
HAENOTYPEN
DER
C
HONDROZYTENDIFFERENZIERUNG
3
2.3
D
ER
ADULTE
G
ELENKKNORPEL
4
2.3.1
D
IE
B
IOCHEMIE
DER
K
NORPELMATRIX
6
2.3.2
D
ER
C
HONDROZYT
7
2.4
IGF-I
UND
SEINE
B
INDUNGSPROTEINE
IM
ADULTEN
G
ELENKKNORPEL
10
2.5
D
EGENERATIVE
K
NORPELVERAENDERUNGEN
-
O
STEOARTHROSE
11
2.5.1
M
ORPHOLOGISCHE
A
LTERATIONEN
11
2.5.2
B
IOCHEMISCHE
A
LTERATIONEN
13
2.5.3
Z
ELLULAERE
A
LTERATIONEN
13
2.6
IGF-I
IN
DER
O
STEOARTHROSE
14
2.7
A
UFGABENSTELLUNG
15
3
ERGEBNISSE
17
3.1
I
SOLATION
VON
G
ESAMT
-RNA
AUS
K
NORPELGEWEBE
17
3.2
Q
UANTIFIZIERENDE
PCR
MIT
DER
T
AQ
M
AN
YY-T
ECHNOLOGIE
18
3.3
E
TABLIERUNG
DER
C
DNA-A
RRAY
-T
ECHNOLOGIE
20
3.3.1
E
NTWICKLUNG
EINES
P
ILOTBLOTS
22
3.4
R
EAKTIVES
V
ERHALTEN
FROEHARTHROTISCHER
VERSUS
NORMALER
C
HONDROZYTEN
AUF
S
TIMULATION
MIT
IGF-I
26
3.4.1
A
LGINAT
-B
EADS
26
3.4.2
G
EWEBEKULTUREN
29
3.4.3
K
ULTUR
UND
S
TIMULATION
VON
K
NORPELPROBEN
31
3.4.4
A
NALYSE
DER
A
GGREKAN
-
SYNTHESE
STIMULIERTER
K
NORPELZELLEN
33
3.4.4.1
DER
GESAMT-PROTEOGLYKANGEHALT
33
3.4.4.2
DIE
AGGREKAN-NEUSYNTHESE
35
3.4.4.3
DIE
GEN-EXPRESSION
VON
AGGREKAN
40
3.4.5
N
ACHWEIS
DER
K
OLLAGENE
T
YP
I,
II
UND
X
41
3.4.5.1
ANALYSE
ZUR
GEN-EXPRESSION
VON
KOLLAGEN
TYP
II
41
3.4.5.2
STUDIE
ZUR
KNORPELZELLDIFFERENZIERUNG
42
3.5
A
NALYSEN
ZUR
G
EN
-E
XPRESSION
VON
IGF-I
UND
IGF-I
R
EZEPTOR
44
3.5.1
N
ACHWEIS
DER
M
RNA
T
RANSKRIPTE
FUER
IGF-I
UND
IGF-I
R
EZEPTOR
IN
NORMALEM
UND
FRUEHARTHROTISCHEM
K
NORPEL
NACH
S
TIMULATION
44
3.5.2
A
NALYSE
DER
G
EN
-E
XPRESSION
VON
IGF-I
IN
HUMANEM
ARTIKULAREN
K
NORPEL
IN
VIVO
45
3.5.3
A
NALYSE
ZUR
G
EN
-E
XPRESSION
DES
IGF-I
R
EZEPTORS
IN
HUMANEM
ARTIKULAREN
K
NORPEL
IN
VIVO
46
3.6
P
HAENOTYPISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
DER
ARTHROTISCHEN
C
HONDROZYTEN
47
3.6.1
P
HAENOTYPISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
MITTELS
P
ILOT
-B
LOT
49
3.6.2
P
HAENOTYPISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
MITTELS
C
LONTECH
-A
RRAY
52
3.6.3
P
HAENOTYPISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
MITTELS
T
AQ
M
AN
YY-A
NALYSE
59
4
DISKUSSION
63
4.1
S
TIMULIERBARKEIT
FRUEHARTHROTISCHER
C
HONDROZYTEN
DURCH
IGF-I
63
4.2
E
XPRESSION
VON
IGF-I
UND
IGF-I
R
EZEPTOR
IM
ADULTEN
G
ELENKKNORPEL
67
4.3
P
HAENOTYPISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
ARTIKULARER
C
HONDROZYTEN
IN
VIVO
68
4.3.1
N
ORMALISIERUNG
DER
E
XPRESSION
68
4.3.2
D
IFFERENTIELLE
G
EN
-E
XPRESSION
IN
VIVO
70
4.4
A
USBLICK
75
5
MATERIAL
UND
METHODEN
77
5.1
M
ATERIAL
77
5.1.1
H
UMANMATERIAL
77
5.1.2
Z
ELLKULTUR
77
5.1.2.1
MEDIEN,
PUFFER
UND
ZUSAETZE
77
5.1.2.2
STIMULANZIEN
78
II
5.1.2.3
ENZYME
78
5.1.3
H
ISTOLOGIE
78
5.1.3.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
HISTOLOGISCHEN
ARBEITEN
78
5.1.3.2
ENZYME
79
5.1.3.3
ANTIKOERPER
80
5.1.4
B
IOCHEMISCHE
P
ROTEOGLYKANBESTIMMUNG
80
5.1.4.1
DNA-BESTIMMUNG
80
5.1.4.2
DMB-ASSAY
81
5.1.4.3
SULFATEINBAU
81
5.1.5
M
OLEKULARBIOLOGIE
82
5.1.5.1
ENZYME
FUER
DIE
MOLEKULARBIOLGIE
82
5.1.5.2
RADIONUKLID
82
5.1.5.3
TAQMANYY
PRIMER
UND
SONDEN
82
5.2
M
ETHODEN
84
5.2.1
Z
ELLKULTUR
84
5.2.1.1
HERSTELLUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
ALGINAT-BEADS
84
5.2.1.1.1
ISOLATION
DER
CHONDROZYTEN
AUS
DER
MATRIX
84
5.2.1.1.2
EINBETTUNG
DER
CHONDROZYTEN
IN
ALGINAT
(NACH
HAEUSELMANN
1992)
84
5.2.1.1.3
KULTIVIERUNG
DER
BEADS
84
5.2.1.2
GEWINNUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
KNORPELSTANZEN
85
5.2.1.2.1
GEWINNUNG
DER
KNORPELSTANZEN
85
5.2.1.2.2
KULTIVIERUNG
UND
STIMULATION
DER
QEWEBESTANZEN
85
5.2.2
B
IOCHEMISCHE
A
NALYSEN
85
5.2.2.1
SULPHATPULSE
85
5.2.2.2
PAPAIN-VERDAU
85
5.2.2.3
SULPHATEINBAU-MESSUNG
(NACH
MASUDA
ET
AL.
1994)
86
5.2.2.4
ZELLZAHLBESTIMMUNG
(NACH
KIM
ET
AL.
1988)
86
5.2.2.5
DMB-ASSAY
86
5.2.3
H
ISTOLOGISCHE
UND
AUTORADIOGRAPHISCHE
S
TUDIEN
87
5.2.3.1
IMMUNHISTOCHEMIE
87
5.2.3.2
HISTOCHEMIE
87
5.2.3.3
AUTORADIOGRAPHIE
88
5.2.3.4
MIKROIMAGER
88
III
5.2.4
M
OLEKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
88
5.2.4.1
RNA-ISOLATION
88
5.2.4.1.1
RNA-MINI-PRAEPARATION
89
5.2.4.1.2
RNA-MIDI-UND
RNA-MAXI-PRAEPARATION
89
5.2.4.1.3
DNASE-VERDAU
89
5.2.4.2
CDNA-SYNTHESE
90
5.2.4.3
KLONIEREN
VON
PCR-AMPLIFIKATEN
90
5.2.4.4
TAQMANYY-PCR
90
5.2.4.4.1
PRIMER-UND
SONDENDESIGN
90
5.2.4.4.2
PRIMERMATRIX
90
5.2.4.4.3
PCR-REAKTION
91
5.2.4.4.4
STANDARDS
91
5.2.4.5
HERSTELLUNG
UND
HYBRIDISIERUNG
EINES
DOTBLOTS
92
5.2.4.6
EXPRESSIONSANALYSE
MIT
DEM
ATLAS
HUMAN
CANCER
1.2
ARRAY
(CLONTECH)
92
5.2.4.6.1
EXPOSITION
UND
ANALYSE
DER
SIGNALE
93
5.3
G
ERAETE
93
6
LITERATUR
94
7
ANHANG
107
8
ABKUERZUNGEN
114
IV |
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