Entdeckung und Charakterisierung eines neuen Zellpermeabilität-vermittelnden Peptidmotives aus den Oberflächenproteinen des Hepatitis-B-Virus:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
5
2.1
DAS
HEPATITIS-B-VIRUS
5
2.1.1
AUFBAU
DER
VIRIONEN
5
2.1.2
GENOMSTRUKTUR
DES
HEPATITIS-B-VIRUS
6
2.1.3
VIRALE
PROTEINE
7
2.1.4
MECHANISMUS
DER
HEPATITIS-B-VIRUS-INFEKTION
13
2.1.5
PATHOLOGIE
DER
HEPATITIS-B-VIRUS-INFEKTION
15
2.2
ZELLPERMEABLE
PEPTIDE
UND
PROTEINE
21
2.2.1
MEMBRANTRANSPORTPROZESSE
BEI
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
21
2.2.2
BEISPIELE
ZELLPERMEABLER
PEPTIDE
UND
PROTEINE
22
2.3
SIGNALTRANSDUKTIONSMECHANISMEN
32
2.3.1
PROTEIN-KINASE
C
32
2.3.2
RAS
33
2.3.3
DERC-RAF-1/MAP2-KINASE-SIGNALTRANSDUKTIONSWEG
33
3
AUFGABENSTELLUNG
37
4
ERGEBNISSE
39
4.1
PRES2
IST
EIN
ZELLPERMEABLES
PROTEIN
_
39
4.1.1
GENTECHNOLOGISCHE
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
DER
VERWENDETEN
REKOMBINANTEN
PROTEINE40
4.1.2
PANTP-PRES2
UND
PRES2
UEBERWINDEN
ZELLMEMBRANEN
IN
VITRO
43
4.1.3
PANTP-PRES2
UND
PRES2
TRANSLOZIEREN
MIT
HOHER
EFFIZIENZ
U.
SIND
ZYTOSOLISCH
LOKALISIERT
44
4.1.4
EXTERN
ZUGEGEBENES
PRES2
AKTIVIERT
DIE
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
AP
1
UNDNF-KB
_
48
4.2
PRES2-VERMITTELTE
ZELLPERMEABILITAET
IST
EIN
PASSIVER,
ENERGIEUNABHAENGIGER
PROZESS
_
49
4.2.1
PRESL
-PRES2
IST
UNEINGESCHRAENKT
ZELLPERMEABEL
BEI
4C
50
4.2.2
PRESL
-PRES2
TRANSLOZIERT
BEI
4C
MIT
UNEINGESCHRAENKTER
EFFIZIENZ
UND
IST
ZYTOSOLISCH
LOKALISIERT
51
43
DAS
TRANSLOKATIONSMOTIV
PRES2-TLM
IST
EINE
AMPHIPHILE
A-HELIX
_
53
4.3.1
PRES2-3S
ZEIGT
EINE
GEGENUEBER
PRES2
STARK
EINGESCHRAENKTE
ZELLPENNEABILITAET
54
4.4
PRES2-TLM
VERMITTELT
ZELLPERMEABILITAET
IN
CALLUS-KULTUREN
VON
LUPINUS
ALBUS
56
4.5
PRES2-TLM
FUNGIERT
ERFOLGREICH
ALS
VEKTOR
FUER
KURZE
PEPTIDMOTIVE
IN
VITRO
_
57
4.5.1
MODULATION
DER
TNF-RI
ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
DURCH
PRES2-TLM
FUSIONSPEP.
57
4.5.2
MODULATION
DER
TNF-RI-ABHAENGIGEN
SIGNALTRANSDUKTION
DURCH
PANTP-FUSIONSPEPTIDE
_
61
4.6
PRES2-TLM
FUNGIERT
ERFOLGREICH
ALS
VEKTOR
FUER
FUNKTIONELLE
PROTEINE
IN
VITRO
_
64
4.6.1
REKOMBINANTE
HERSTELLUNG
UND
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
VON
6H-PRES2
TLM-EGFP
UND
6H-EGFP
64
4.6.2
PRES2-TLM-EGFP
FUSIONSPROTEINE
TRANSLOZIEREN
IN
VITRO
UEBER
DIE
ZELLMEMBRAN
_
67
4.6.3
DIE
TRANSLOKATION
VON
PRES2-TLM-EGFP-FUSIONSPROTEINEN
ERFOLGT
ENERGIEUNABHAENGIG
68
4.6.4
PRES2-TLM-EGFP
FUSIONSPROTEINS
TRANSLOZIEREN
IN
PRIMAERZELLEN
DES
KNOCHENMARKS
DER
MAUS
70
4.7
PRES2-TLM
FUEHRT
NICHT
ZUR
VERBESSERUNG
DES
TRANSPORTES
VON
POLYLYSIN-DNA
KOMPLEXEN
IN
KULTIVIERTE
ZELLEN
70
4.7.1
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHER
NACHWEIS
VON
EGFP/PRES2-TLM-PL
BZW.
EGFP/PL
IN
293
ZELLEN
71
4.8
PRES2-TLM
VERMITTELT
IN
VIVO
ZELLPENNEABILITAET
72
4.8.1
PRES2
TRANSLOZIERT
NACH
PFORTADERINFUSION
IN
DIE
LEBER
72
4.8.2
6H-PRES2-TLM-EGFP
IST
NACH
INJEKTION
IN
DIE
PFORTADER
IN
DER
LEBER
VON
MAEUSEN
NACHWEISBAR
74
5
DISKUSSION
77
5.1
PRES2
IST
EIN
ZELLPERMEABLES
PROTEIN
_
77
5.2
PRES2-TLM
IST
EIN
NEUES
ZELLPERMEABILITAET
VERMITTELNDES
MOTIV
78
53
EIGENSCHAFTEN
DER
ZELLPERMEABILITAET
VON
PRES2-TLM
78
5.3.1
PRES2-TLM
VERMITTELT
ZELLPERMEABILITAET
IN
PFLANZLICHE
ZELLKULTUREN
UND
IN
TIERISCHE
ZELLEN
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
78
5.3.2
PRES2-TLM-VERMITTELTE
ZELLPERMEABILITAET
IST
SCHNELL
UND
EFFIZIENT
79
5.3.3
TRANSPORTMECHANISMUS
79
5.3.4
ART
DER
VON
PRES2-TLM
TRANSPORTIERTEN
FRACHT
85
5.4
BIOTECHNOLOGISCHE
UND
THERAPEUTISCHE
ANWENDUNGEN
86
5.4.1
ZELLPERMEABLE
PEPTIDE
ZUR
SPEZIFISCHEN
MODULATION
DER
SIGNALTRANSDUKTION
88
5.4.2
ANWENDUNGEN
DES
TRANSPORTS
FUNKTIONELLER
PROTEINE
IN
VITRO,
EX
VIVO
UND
IN
VIVO
90
5.4.3
WEITERE
ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN
90
5.4.4
EINSCHRAENKUNGEN
DER
THERAPEUTISCHEN
ANWENDUNGEN
91
5.5
BEDEUTUNG
DER
PRES2-TLM-VERMITTELTEN
ZELLPERMEABILITAET
FUER
DEN
INFEKTIONSMECHANISMUS
VON
HBV
91
5.5.1
DIE
AMPHIPHILE
A-HELIX
IST
ZWISCHEN
VERSCHIEDENEN
HBV-SUBTYPEN
KONSERVIERT
91
5.5.2
ANALOGE
MOTIVE
BEI
ANDEREN
HEPADNAVIREN
95
5.5.3
MODELL
DER
HBV
INFEKTION
99
6
MATERIAL
107
6.1
GERAETE
107
6.2
BAKTERIENSTAEMME
UND
ZELLLINIEN
108
63
ENZYME
_
108
6.4
ANTIKOERPER
108
6.4.1
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
(MAUS)
_
108
6.4.2
POLYKLONALE
ANTIKOERPER
108
6.4.3
KONJUGIERTE
ANTIKOERPER
109
6.5
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
_
109
6.5.1
PRIMER
FURDIE
PCR
109
6.5.2
KONSENSUS-OLIGONUKLEOTIDE
FUER
EMSA
109
6.6
PLASMIDE
_
109
6.7
VERWENDETE
SAEULEN
110
6.8
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
_110
6.9
RADIOCHEMIKALIEN
112
6.10
LOESUNGEN
UND
KULTURMEDIEN
112
VI
7
METHODEN
121
7.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
121
7.1.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
121
7.1.2
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
121
7.1.3
PHENOL/CHLOROFORM
EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
121
7.1.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
121
7.1.5
DNA-FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
PRAEPARATIVEN
AGAROSEGELEN
122
7.1.6
RESTIKTIONSVERDAU
_
122
7.1.7
5
'
-DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
122
7.1.8
5
'
-PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
MITTELS
POLYNUKLEOTIDKINASE-RADIOAKTIVEMARKIERUNG
123
7.1.9
DNA-LIGATION
123
7.1.10
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
123
7.1.11
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
124
7.1.12
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
E.
COLI
125
7.1.13
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
125
7.2
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
126
7.2.1
KULTIVIERUNG
UND
PASSAGIEREN
VON
SAEUGERZELLEN
126
7.2.2
ZYTOSOLPRAEPARATION
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
126
7.2.3
KEMPRAEPARATION
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
127
7.2.4
TRITONX-100
GESAMTZELLEXTRAKTE
FUER
DIE
IMMUNPRAEZIPITATION.
127
7.2.5
ZELLAUFSCHLUSS
VON
CALLUS-KULTUREN
128
73
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
128
7.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
128
7.3.2
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
128
7.3.3
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
SDS-PAGE
128
7.3.4
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
_
130
7.3.5
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
130
7.3.6
AUTORADIOGRAPHIE
130
7.3.7
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
130
7.3.8
INDUKTIONSKULTUR
VON
E.
COLI
M15PREP4
131
7.3.9
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
MITTELS
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHER
METHODEN
131
7.3.10
IMMUNOBLOT
133
7.3.11
IMMUNKOMPLEXUNTERSUCHUNG
_
133
7.3.12
GELRETARDIERUNGS-BESTIMMUNG
(EMSA)
134
7.3.13
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
UNTER
VERWENDUNG
VON
EGFP-FUSIONSPROTEINEN
_
135
7.4
HISTOLOGISCHE
UND
IMMUNHISTOCHEMISCHE
METHODEN
135
7.4.1
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
VON
VERTEBRATEN-ZELLEN
135
7.4.2
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
VON
GEWEBESCHNITTEN
_
135
7.5
TIEREXPERIEMENTELLE
METHODEN
_
136
7.5.1
VERSUCHSTIERE
UND
NARKOSE
136
7.5.2
LEBERPWFUSION
136
8
LITERATUR
137
9
ABKUERZUNGEN
149
10
DANKSAGUNG
151
11
LEBENSLAUF
153
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