Identifizierung von Protein-Transport-Faktoren in der Hefe Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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| Beschreibung: | 105 S. Ill., graph. Darst. : 30 cm |
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SEITE 3
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.7
2 MATERIAL UND METHODEN.16
2.1 STAEMME UND MEDIEN.16
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME.16
2.1.2 MEDIEN UND ANZUCHT VON E.
COLI.16
2.1.3 HEFESTAEMME.16
2.1.4 MEDIEN UND ANZUCHT VON HEFESTAEMMEN.18
2.2 PLASMIDE.18
2.3 GENBANKEN. 21
2.4 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE.21
2.5 CHEMIKALIEN UND ENZYME.24
2.6 ANTIKOERPER.24
2.7 TRANSFORMATION.25
2.7.1 TRANSFORMATION VON
E. COLI.25
2.7.2 TRANSFORMATION VON S.
CEREVISIAE.25
2.8 PRAEPARATION VON DNA.25
2.8.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI.25
2.8.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS S.
CEREVISIAE.26
2.8.3 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS S.
CEREVISIAE.26
2.9 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA.26
2.9.1 DNA-RESTRIKTION.26
2.9.2 AUFFUELLREAKTION VON 5'-UEBERSTEHENDEN ENDEN.26
2.9.3 ENTFERNUNG VON 3'-UEBERSTEHENDEN ENDEN.26
2.9.4 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN.27
2.9.5 LIGATION.27
2.10 PCR-AMPLIFIZIERUNG VON DNA.27
2.10.1 SPEZIFISCHE AMPLIFIKATION VON PLASMID-DNA.27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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SEITE 4
INHALTSVERZEICHNIS
2.10.2 SPEZIFISCHE AMPLIFIKATION VON CHROMOSOMALER DNA.28
2.10.3 SEMI-RANDOM-PCR (ST-PCR).28
2.11 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN.29
2.12 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN.29
2.13 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION.29
2.14 SEQUENZIERUNG VON DNA.29
2.15 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN FUER WESTERN-ANALYSE.30
2.16 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION.30
2.17 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN IN SDS-
POLYACRYLAMIDGELEN.30
2.18 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS VON PROTEINEN DURCH WESTERN-ANALYSE.31
2.19 ZELLFRAKTIONIERUNGEN.31
2.19.1 DIFFERENTIELLE ZENTRIFUGATION.31
2.19.2 SUCROSEGRADIENTEN.32
2.20 PULSE-CHASE-EXPERIMENTE.32
2.21 CPY-SORTING.
33
2.22 IMMUNPRAEZIPITATION.
33
2.23 FAST GARNET PLATTENTEST AUF AKTIVITAET DER CARBOXYPEPTIDASE Y.34
2.24 BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET.34
2.24.1 QUANTITATIVE ENZYMTESTS.34
2.24.2 LACZ FILTERTEST.35
2.24.3 LACZ OVERLAY-ASSAY.35
2.25 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN.35
2.25.1 GFP.
36
2.25.2 AUFNAHME VON FM4-64.
33
2.25.3 IMMUNFLUORESZENZ.
36
2.26 BESTIMMUNG DER PAARUNGS-AKTIVITAET.36
2.27 KREUZUNG VON HEFESTAEMMEN UND TETRADENANALYSE.37
2.28 EMS-MUTAGENESE.
37
2.29 GEN-DELETION UND GEN-MODIFIKATION IN S.
CEREVISIAE.37
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE 5
3 ERGEBNISSE.39
3.1 IDENTIFIZIERUNG VON STE6-LNTERAKTIONSPARTNEM.39
3.1.1 SCREEN MIT TWO HYBRID-GENBANKEN.39
3.1.2 IDENTIFIZIERUNG DER GENBANKPLASMID-KODIERTEN AD-FUSIONEN.43
3.1.3 EINFLUSS VON PKC1 AUF DIE FUNKTION UND STABILITAET VON STE6.46
3.1.3.1 TWO HYBRID-EXPERIMENTE MIT VERSCHIEDENEN PKC1-VARIANTEN.46
3.1.3.2 EINFLUSS VON PKC1 AUF FUNKTION UND UMSATZ VON STE6.46
3.1.3.3 WACHSTUMSDEFEKT DURCH UEBEREXPRESSION VON PKC R398A.47
3.1.4 EINFLUSS VON
BLM3, YNL201C UND YGL211C AUF STE6.47
3.2 SCREENING NACH MUTANTEN MIT ERHOEHTER STE6-STABILITAET.48
3.2.1 KONSTRUKTION EINES MUTAGENESESTAMMES
.
7
.
.49
3.2.2 KONSTRUKTION VON STE6-FUSIONSPROTEINEN.51
3.2.3 CHARAKTERISIERUNG DES STE6-HIS3-FUSIONSPROTEINS.52
3.2.3.1 TEST AUF FUNKTIONALITAET DES FUSIONSPROTEINS.52
3.2.3.2 STABILISIERUNG VON STE6-HIS3 IN EINER PEP4-MUTANTE.52
3.2.3.3 VERGLEICH DER INTRAZELLULAEREN LOKALISATION VON STE6 UND
STE6-HIS3.53
3.2.4 MUTAGENESEVERSUCHE MIT RKY1050.54
3.2.5 KONSTRUKTION EINES VERBESSERTEN MUTAGENESESTAMMES.55
3.2.5.1 YYCURING" VON ENDOGENEM 2P-PLASMID.55
3.2.5.2 STABILE INTEGRATION VON CUP1P-STE6-HIS3 IN SUC2.55
3.2.5.3 WACHSTUMSVERGLEICH DER MUTAGENESESTAEMME.56
3.2.6 MUTAGENESE VON RKY1393.57
3.3 IDENTIFIZIERUNG VON GENFUNKTIONEN, DIE BEI UEBERPRODUKTION STE6
STABILISIEREN.59
3.4 CHARAKTERISIERUNG EINER AM SPAETEN ENDOSOM WIRKENDEN
PROTEINFAMILIE.63
3.4.1 STABILISIERUNG VON STE6 IN
VPS4-, SNF7-, MOS1- UND MOS2-STAEMMEN.63
3.4.2 SEQUENZVERGLEICH DER PROTEINE.64
3.4.3 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN DER DELETIONSSTAEMME.65
3.4.4 VERGLEICH DES CPY-TRANSPORTS. 66
SEITE 6
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.5 LOKALISATION DES IN DEN DELETIONSSTAEMMEN BETROFFENEN
TRANSPORTSCHRITTS.68
3.4.5.1 AUFNAHME VON FM4-64.68
3.4.5.2 LOKALISATION VON STE6.70
3.4.6 LOKALISATION VON MOS1.76
3.4.7 SUCHE NACH INTERAKTIONSPARTNERN VON MOS1.81
4 DISKUSSION.85
4.1 IDENTIFIZIERUNG VON STE6-LNTERAKTIONSPARTNERN.85
4.2 SUCHE NACH MUTANTEN MIT ERHOEHTER STE6-STABILITAET.87
4.3 CHARAKTERISIERUNG EINER AM SPAETEN ENDOSOM WIRKENDEN FAMILIE
YYCOILED-COIL'-BILDENDER PROTEINE.88
4.3.1 LOKALISIERUNG VON MOS1.89
4.3.2 MOEGLICHE FUNKTIONEN VON MOS1.90
4.3.3 DIE SNF7-PROTEINFAMILIE.
91
4.3.4 SUCHE NACH INTERAKTIONSPARTNERN VON MOS1.92
5 ZUSAMMENFASSUNG.94
6 LITERATURVERZEICHNIS.95
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.102 |
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