Studien zur Lokalisation und Topologie von Transportproteinen der plastidären Hüllmembran:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I.
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
II.
VERZEICHNIS
DER
TABELLEN
III.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
PRINZIPIEN
INTRAPLASTIDARER
PROTEINSORTIERUNG
L
1.2.
DER
TRIOSEPHOSPHAT/PHOSPHAT-TRANSLOKATOR
7
1
3.
PFLANZLICHE
KALIUMKANAELE
8
1.4.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
13
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
15
2
1.
PFLANZENMATERIAL
UND
ANZUCHT
15
2
1.1
ANZUCHT
VON
SPINAT
(SPINACEA
OLERACEA)
15
2
1.2.
ANZUCHT
VON
ERBSE
(PISUM
SATIVUM)
16
2
1.3
ANZUCHT
ARABTDOPSIS
THAHANA
16
2
1.3
1.
STERILISATION
DES
SAATGUTS
16
2
1.3
2.
ANZUCHT
ZUR
GEWINNUNG
VON
BLATTMATERIAL
17
2.1.3.3.
ANZUCHT
ZUR
GEWINNUNG
VON
WURZELMATERIAL
17
2.2.
ISOLATION
VON
PLASTIDEN
UND
ENDOMEMBRANEN
18
2.2.1.
ISOLIERUNG
VON
CHLOROPLASTEN
AUS
SPINAT
(SPINACIA
OLERACCEA)
18
2
2.2.
REINIGUNG
INTAKTER
CHLOROPLASTEN
MITTELS
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
19
2.2.3.
ISOLIERUNG
VON
CHLOROPLASTEN
AUS
ERBSE
(PISUM
SATIVUM)
UND
ANREICHERUNG
EINES
STROMALEN
EXTRAKTES
19
2.2.4.
ISOLATION
NICHT-GRUENER
PLASTIDEN
AUS
BLUMENKOHL
(BRASSICA
OLERACEA)
20
2.2.5.
ISOLATION
VON
CHLOROPLASTEN
AUS
ARABTDOPSIS
THALIANA
21
2.2
6.
BESTIMMUNG
DER
PLASTIDENKONZENTRATION
22
2
2
7.
PRAEPARATION
VON
ENDOMEMBRANEN
AUS
A.
THAHANA
22
2.2.8.
SACCHAROSE-DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFIIGATION
23
2
3
IN
ORGANELLO
BINDUNG
UND
IMPORT
VON
PROTEINEN
IN
INTAKTE
PLASTIDEN
24
2.3.1.
IN
VITRO
SYNTHESE
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROTEINE
24
2.3.1.1.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
KLONIERTER
CDNA
24
2.3.1
2.
IN
VITRO
TRANSLATION
IM
ZELLFREIEN
SYSTEM
25
2.3.1.3.
GEKOPPELTE
IN
VITRO
TRANSKRIPTION/TRANSLATION
IM
ZELLFREIEN
SYSTEM
(TNT)
25
2.3.2.
IN
VITRO
PROZESSIERUNG
26
2.3.3.
PROTEASE-VORBEHANDLUNG
VON
CHLOROPLASTEN
UND
NICHT-GRUENEN
PLASTIDEN
27
2.3.4.
BINDUNG
UND
IMPORT
VON
IN
VITRO
TRANSLATIONSPRODUKTEN
IN
INTAKTE
PLASTIDEN
27
2.3.5
PROTEASE-NACHBEHANDLUNG
DER
PLASTIDEN
28
2.3.6
FRAKTIONIERUNG
DER
PLASTIDEN
DURCH
DIFFERENTIELLE
ZENTRIFUGATION
29
2.3.6.1
FLIESSDIAGRAMM
FRAKTIONIERUNG
DER
PLASTIDEN
DURCH
DIFFERENTIELLE
ZENTRIFUGATION
30
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.
PROTEIN-BIOCHEMISCHE
METHODEN
31
2.4.1.
PROBENVORBEREITUNG
31
2.4
2.
PROTEINBESTIMMUNG
31
2.4.3
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
32
2.4
4.
FAERBEMETHODEN
FUER
POLYACRYLAMIDGELE
33
2.4.4.1.
FAERBUNG
DER
PROTEINE
DURCH
COOMASSIE
BLAU
33
2.4.4.2.
FAERBUNG
DER
PROTEINE
DURCH
SILBEMITRAT
33
2.4.5
FLUOROGRAPHIE
UND
DENSITOMETRIE
34
2.4.6
PROTEINTRANSFER
AUF
BLOTTINGMEMBRANEN
(WESTERN
BLOT)
34
2.4
6.1.
PROTEIN-NACHWEIS
AUF
BLOTTINGMEMBRANEN
MIT
PONCEAU
S
35
2.4
6.2
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
35
2.4
6.3.
PEIJODAT-OXIDATION
36
2.4.7.
ANTIKOERPERGEWINNUNG
37
2.4.8.
IMMUNPRAEZIPITATIONEN
37
2.4.9
ERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
EINES
FUSIONSPROTEINS
38
2.4.9.1.
ERSTELLUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
38
2.4.9.2.
PROTEINISOLATION
AUS
E.
COLI
39
2.4
9.3.
REINIGUNG
HETEROLOGER
PMAL-FUSIONSPROTEINE
UEBER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
40
2.5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
40
2.5
1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARD
METHODEN
40
2.5
1.1.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
41
2.5.2.
ESCHERICHIA
CO/Z-STAEMME
UND
PLASMIDE
41
2.5.3
ANZUCHT
UND
TRANSFORMATION
VON
ECOZZ-BAKTERIEN
42
2.5.3
1.
ANZUCHT
VONE.
COLI
42
2.5.3.1.1
HERSTELLUNG
TSS-KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
43
2
5.3.1
2.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
44
2.5.3.2.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
44
2.5.4.
SOUTHERN-BLOT
45
2
5.4.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
45
2.5
4.2.
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHEM-BLOTS
46
2
6.
ISOLATION
UND
ANALYSE
VON
RNA
AUS
A.
IHALIANA
47
2.6.1.
PRAEPARATION
VON
RNA
47
2.6.2.
RNA-GELE
48
2.6.3
NORTHERN-BLOT
49
2.7.
RT-PCR
49
2.7.1.
DNASE
VERDAU
49
2.7.2.
REVERSE
TRANSKRIPTION
50
2.7.3.
PCR
50
2
8
DNA-SEQUENZIERUNG
50
2.9.
MATERIALIEN
UND
CHEMIKALIEN
51
3.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
52
3.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZU
TOPOGENEN
SIGNALEN
DES
TRIOSEPHOSPHAT/PHOSPHAT
TRANSLOKATORS
AUS
SPINAT
52
3
1.1.
DELETIERTE
FORMEN
DES
TPT'S
VERBLEIBEN
IN
DER
INNEREN
HUELLMEMBRAN
DES
CHLOROPLASTEN
53
INHALTSVERZEICHNIS
3.1
1
1
ERSTELLUNG
DES
KONSTRUKTES
PT3
11
55
3.1.1.2.
ERSTELLUNG
DES
KONSTRUKTES
PT80-PT343-404
55
3.1.1
3.
ERSTELLUNG
DES
KONSTRUKTES
PT80-PT
155-404
56
3.1.1.4.
ERSTELLUNG
DES
KONSTRUKTES
PT123-PT155-404
56
3.1.1.5.
PROTEINIMPORT
DER
DELETIERTEN
FORMEN
DES
TPT'S
56
3.1.2.
FUSIONSPROTEINE
AUS
N-TERMINALEN
BEREICHEN
DES
TPT'S
UND
DEM
REIFEN
TEIL
DES
LHCP
'
S
ZEIGEN
UNTERSCHIEDLICHE
PLASTIDAERE
SUBLOKALISATION
62
3.1
2.1.
ERSTELLUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
PT80-LHCP
63
3.1
2.2.
ERSTELLUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
PT123-LHCP
64
3.1.2.3.
ERSTELLUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
PT
154-LHCP
64
3
1
2.4.
PROTEINIMPORT
DER
TPT/LHCP-FUSIONSPROTEINE
64
3.1.3.
KONSTRUKTION
VON
GENKASSETTENSYTEMEN
ZUR
ANALYSE
DEFINIERTER
PROTEINDOMAENEN
DES
TPT'S
67
3.1.4.
PROTEINIMPORTE
VON
HYBRIDPROTEINEN,
DIE
MIT
HILFE
DER
GENKASSETTENSYTEME
ERSTELLT
WURDEN
72
3
1.4.1.
SUBPLASTIDAERE
VERTEILUNG
HYBRIDER
PROTEINE,
DIE
EINE
MEMBRANSPANNE
DES
TPT
'
S
BEINHALTEN
72
3.1.4.2.
SUBPLASTIDAERE
VERTEILUNG
HYBRIDER
PROTEINE,
DIE
ZWEI
MEMBRANSPANNEN
DES
TPT'S
BEINHALTEN
76
3.1.5.
ZUSAMMENFASSENDE
DISKUSSION
DER
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
TOPOGENER
SIGNALE
DES
TPT'S
81
3.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ZELLULAEREN
SUBLOKALISATION
DES
PUTATIVEN
KALIUMKANALS
AKT4
87
3.2.1.
EXPRESSIONSMUSTER
DES
AKT4
90
3
2
1.1
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
90
3.2.12.
RT-PCR-ANALYSE
91
3.2.2.
IN
VITRO
PROZESSIERUNG
DES
AKT4
92
3.2.3
IN
ORGANELLO
PROTEINIMPORTE
94
3.2
3.1.
IN
ORGANELLO
PROTEINIMPORTE
DES
AUTHENTISCHEN
AKT4-PROTEINS
94
3.2.3.2.
ERSTELLUNG
UND
IN
ORGANELLO
PROTEINIMPORT
DES
FUSIONSPROTEINS
AKT4
37ER
97
3.2.4.
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SUBLOKALISATION
DES
AKT4-PROTEINS
100
3
2.4
1.
ERSTELLUNG
EINES
GEGEN
AKT4
GERICHTETEN
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
UND
ERSTE
CHARAKTERISIERUNG
100
3.2.4.2.
ERSTELLUNG
UND
HETEROLOGE
EXPRESSION
EINES
MBP-AKT4-FUSIONSPROTEINS
101
3.2
4.3.
SUBZELLULAERE
FRAKTIONIERUNG
UND
LOKALISATION
DES
AKT4
103
3.2
5
ZUSAMMENFASSENDE
DISKUSSION
DER
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISATION
DES
PFLANZLICHEN
KALIUMKANALS
AKT4
105
4.
ZUSAMMENFASSUNG
108
S.
LITERATURVERZEICHNIS
110 |
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