Der niedere Eukaryont Dictyostelium discoideum als alternatives Expressionssystem eines in vitro synthetisierten Proteinase K Gens und zweier artifizieller Pseudomonas aeruginosa-Antigene:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Frankfurt (Main), Univ., Diss., 1999 |
| Beschreibung: | IV, 144 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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INHALT
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINFUEHRUNG
3
2.1.
DER
ZELLULAERE
SCHLEIMPILZ
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
.
3
2.1.1.
ALLGEMEINE
BIOLOGIE
UND
LEBENSZYKLUS
.
3
2.1.1.1.
FRUEHE
ENTWICKLUNG
.
6
2.1.2.
DAS
GENOM
VON
D.
DISCOIDEUM
.
7
2.1.2.1.
CODONPRAEFERENZEN
.
7
2.2.
PROTEINASE
K
AUS
TRITIRACHIUM
ALBUM
LIMBER
.
10
2.2.1.
DER
PILZ
TRITIRACHIUM
ALBUM
LIMBER
.
10
2.2.2.
PROTEASEN
.
10
2.2.2.1.
PROTEINASE
K
.
11
2.3.
DIE
ARTIFIZIELLEN
ANTIGENE
.
13
2.3.1.
DAS
BAKTERIUM
PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
.
13
2.3.2.
UEBERBLICK
DER
VAKZINENTWICKLUNG
GEGEN
P.
AERUGINOSA
.
14
2.3.3.
ENTWICKLUNG
DER
ARTIFIZIELLEN
ANTIGENE
.
15
2.4.
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
D.
DISCOIDEUM
.
,
.
17
2.5.
ZIELSETZUNG
.
19
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
21
3.1.
CHEMIKALIEN,
GERAETE
UND
IHRE
BEZUGSQUELLEN
.
:
.
21
3.2.
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
23
3.3.
MEDIEN
.
25
3.4.
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
3.4.1.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
GENSYNTHESE
VON
PROTEINASE
K
.
26
3.4.2.
MUTAGENESEPRIMER
.
27
3.4.3.
SPEZIELLE
SEQUENZIERPRIMER
.
28
3.4.4.
PRIMER
FUER
POLYMERASEKETTENREAKTIONEN
.
28
3.4.5.
SONSTIGE
PRIMER
.
29
3.5.
VERWENDETE
ORGANISMEN
.
29
3.6.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
30
3.7.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
31
3.7.1.
ZUECHTUNG
VON
D.
DISCOIDEUM
.
31
3.7.2.
DMSO
GEFRIERSTOCKS
VON
D.
DISCOIDEUM
.
32
3.7.3.
SPORENPRAEPARATION
(SILIKASTOCKS)
VON
D.
DISCOIDEUM
.
32
3.8.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
32
3.8.1.
TRANSFORMATION
VON
D.
DISCOIDEUM
.
32
3.8.2.
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
D.
DISCOIDEUM
.
33
3.8.3.
INDUKTION
DES
DD
RAS-PROMOTORS
MIT
CAMP
.
34
3.8.4.
TRANSFORMATION
CACH-KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
34
3.8.5.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
DURCH
ELEKTROPORATION
.
34
3.8.6.
INDUKTION
MIT
IPTG
.
35
3.8.7.
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
ZUM
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
MRNA
.
36
3.8.8.
HERSTELLUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
.
36
3.8.9.
IN
VITRO
MUTAGENESE
(DUF/UNG
'
METHODE)
.
37
3.8.10.
IN
VITRO
GENSYNTHESE
VON
PROTEINASE
K
.
37
3.8.10.1.
KONDENSATION
VON
DNA-EINZELSTRAENGEN
.
38
3.8.10.2.KONDENSATION
VON
DNA-DOPPELSTRAENGEN
.
38
3.8.11.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
SANGER
.
39
3.8.12.
CYCLE-SEQUENCING
.
40
3.8.13.
HYBRIDISIERUNGSMETHODEN
.
40
3.9.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
41
3.9.1.
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
.
41
3.9.1.1.
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
R250
.
42
3.9.1.2.
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
42
3.9.2.
PROTEASE-AKTIVITAETSTEST
MIT
RESORUFIN
MARKIERTEM
CASEIN
SUBSTRAT
.
44
3.9.3.
ELISA
.
44
3.9.4.
RENATURIERUNG
VON
PROTEINASE
K
AUS
YYINCLUSION
BODIES
"
.
45
3.9.4.I.
RENATURIERUNG
MIT
ANSCHLIESSENDER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
45
3.9.4.2.
NI-NTA
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
ANSCHLIESSENDER
RENATURIERUNG
.
46
3.9.5.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
NACH
BRADFORD
.
47
3.9.6.
PROTEINREINIGUNG
DES
ARTIFIZIELLEN
ANTIGENS
OPRF-OPRI
AUS
D.
DISCOIDEUM
.
47
3.9.6.1
.
NI
2+
-NTA
AFFINITAETSREINIGUNG
.
47
3.9.6.2.
LONENAUSTAUSCH
CHROMATOGRAPHIE
.
48
4.
ERGEBNISSE
PROTEINASE
K
50
4.1.
EXPRESSION
DES
AUTHENTISCHEN
GENS
PK
TA
IN
D.
DISCOIDEUM
.
50
4.1.1.
PRAE-PRO-PROTEINASE
K
TR
UNTER
DISCOIDIN
LY-PROMOTOR
KONTROLLE
.
50
4.1.1.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PDLD-PPPK
TX
.
50
4.1.1.2.
ANALYSE
DER
ZELLEXTRAKTE
UND
KULTURUEBERSTAENDE
.
51
4.1.2.
CSA/PROTEINASE
K
T
'
"
'
-FUSIONSPROTEIN
UNTER
RAS-PROMOTOR
KONTROLLE
.
52
4.1.2.1.
DER
AUSGANGSVEKTOR
PER
III
.
53
4.1.2.2.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PER
NI-PK
TX
.
53
4.I.2.3.
NACHWEIS
DER
REGULIERBARKEIT
DES
RAS-PROMOTORS
.
54
4.1.2.4.
ANALYSE
DER
ZELLEXTRAKTE
UND
KULTURUEBERSTAENDE
.
55
4.I.2.5.
ERGEBNISSE
DES
PROTEASE-AKTIVITAETSTESTS
.
56
4.2.
SYNTHESE
EINES
PROTEINASE
K
GENS
IM
YYCODON
USAGE
"
VON
D.
DISCOIDEUM
.
58
4.2.1.
DESIGN
DES
GENS
PK?*
.
58
4.2.1.1.
VERWENDETE
TRIPLETTS
.
58
4.2.1.2.
SEQUENZSPEZIFISCHER
AUSTAUSCH
VON
BEVORZUGTEN
TRIPLETTS
.
60
4.2.1.3.
DIE
PRIMER
.
60
4.2.I.4.
ANALYSE
UND
DATEN
DES
KONSTRUIERTEN
GENS
.
61
4.2.2.
SYNTHESE
DES
GENS
PK?
D
'
.
62
4.2.2.1.
SUKZESSIVER
ZUSAMMENBAU
.
62
4.2.2.2.
SEQUENZANALYSE
DES
RESULTIERENDEN
DNA-DOPPELSTRANGS
.
64
4.2.2.3.
IN
VITRO
MUTATIONEN
ZUM
KORREKTEN
PROTEINASE
K
GEN
.
64
4.3.
EXPRESSION
DES
SYNTHETISCHEN
GENS
PK
011
IN
D.
DISCOIDEUM
.
65
4.3.1.
CSA/PROTEINASE
K
DD
-FUSIONSPROTEIN
UNTER
RAS-PROMOTOR
KONTROLLE
.
65
4.3.1.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PER
III-PK
DD
'
.
65
4.3.I.2.
ANALYSE
DER
ZELLEXTRAKTE
UND
KULTURUEBERSTAENDE
.
66
4.3.2.
CSA/PROTEINASE
K
DD
7HIS-TAG-FUSIONSPROTEIN
UNTER
RAS-PROMOTOR
KONTROLLE
.
67
4.3.2.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PER
IH-PK
D
'
D
+HIS
.
67
4.3.2.2.
ANALYSE
DER
ZELLEXTRAKTE
UND
KULTURUEBERSTAENDE
.
67
4.3.3.
CSA/PROTEINASE
K
D
D
'
/HIS-TAG-FUSIONSPROTEIN
UNTER
ACTIN
15-PROMOTOR
KONTROLLE
.
69
4.3.3.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PDXAL-PK
DD
'3H
.
69
4.3.3.2.
ANALYSE
DER
ZELLEXTRAKTE
.
70
4.4.
VERGLEICH
DER
BEIDEN
PROTEINASE
K
GENEN:
PK
0
*
UND
PK
7
"
.
71
4.4.1.
VERGLEICH
DER
TRANSKRIPTION
VON
PK?
'
1
'
UND
PK
7
*'
.
71
4.4.2.
VERGLEICH
DER
EXPRESSION
VON
PKP^
UND
PK
TA
'
.
74
4.4.3.
AUSWERTUNG
.
YY.
.
75
4.5.
EXPRESSION
DES
SYNTHETISCHEN
GENS
PK?
D
'
IN
E.
COLI
.
79
4.5.1.
DER
AUSGANGSVEKTOR
PET-22B
.
79
4.5.2.
PEL
B/PROTEINASE
K
DD
-FUSIONSPROTEIN
.
80
4.5.2.I.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PET-PK
DD
'
.
81
4.5.2.2.
WESTERN
BLOT
ANALYSE
EINER
E.
CO/I-TRANSFORMANDE
.
81
4.5.2.3.
LOKALISIERUNG
UND
STRUKTUR
DES
EXPRIMIERTEN
PROTEINS
.
82
4.5.2.4.
SOHIBILISIERUNGS
UND
RENATURIERUNGSEXPERIMENTE
VON
YYINCLUSION
BODIES
"
.
83
4.5.2.5.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PET-PK
DD
+HIS
.
85
4.5.3.
PROTEINASE
K
DD
7HIS-TAG-FUSIONSPROTEIN
.
85
4.5.3.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSPLASMIDS
PETAL-PK
DD
+HIS
.
86
4.5.3.2.
RENATURIERUNG
MIT
ANSCHLIESSENDER
AFFINITAETSREINIGUNG
.
86
4.5.3.3.
AFFINITAETSREINIGUNG
MIT
ANSCHLIESSENDER
RENATURIERUNG
.
89
4.5.3.4.
AFFINITAETSREINIGUNG
UND
RENATURIERUNG
IM
VERGLEICH
ZU
EINER
KONTROLLE
.
91
5.
ERGEBNISSE
ARTIFIZIELLE
PSEUDOMONAS
AERUGINOSA-ANTIGENE
93
5.1.
KLONIERUNG
DER
ARTIFIZIELLEN
GENE
OPRI-OPRF
UND
OPRF-OPRI
.
93
5.1.1.
DIE
MANSTEIN-VEKTOREN
.
93
5.1.2.
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
PDXA-I/F
3H
UND
PDXD-I/F
3H
.
95
5.1.3.
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
PDXA-F/13H
UND
PDXD-F/13H
.
96
5.2.
EXPRESSION
DER
ARTIFIZIELLEN
ANTIGENE
OPRI-OPRF
UND
OPRF-OPRI
.
97
5.2.1.
EXPRESSION
IN
DEM
D.
DISCOIDEUM-STAMM
AX2
.
97
5.2.2.
EXPRESSION
IN
DEM
D.
DISCOIDEUM-STAMM
AX3-ORF*
.
98
5.2.3.
EXPRESSION
IN
DEM
D.
DISCOIDEUM-STAMM
VI88
.
99
5.3.
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
VON
OPRF-OPRI
AUS
VI88-ZELLEN
.
100
5.3.1.
ENTWICKLUNG
EINER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
FUER
OPRF-OPRI
.
101
5.3.2.
ENTWICKLUNG
EINER
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
FUER
OPRF-OPRI
.
103
5.3.2.1.
ERGEBNISSE
DES
KOMBINIERTEN
REINIGUNGSVERFAHRENS
.
104
5.3.3.
ERGEBNISSE
DER
REINIGUNG
VON
OPRF-OPRI
IN
EINER
GROSSPRAEPARATION
.
106
5.3.4.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
OPRF-OPRI
AUS
DEM
ZELLEXTRAKT
EINER
HISACTOPHILIN-DEFEKTMUTANTE
.
109
5.3.4.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
HISACTOPHILIN-DEFEKTMUTANTE
AX2
BSR
512
.
110
5.3.4.2.
ERGEBNISSE
DER
REINIGUNG
VON
OPRF-OPRI
AUS
AX2
BSR
512-ZELLEN
.
111
5.4.
ERGEBNISSE
DER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
VON
OPRI-OPRF
AUS
VI88-ZELLEN
.
114
6.
DISKUSSION
115
6.1.
EINFLUSS
VARIABLER
PARAMETER
AUF
DIE
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
D.
DISCOIDEUM
.
115
6.1.1.
PROMOTOREN
.
116
6.1.2.
SIGNALSEQUENZEN
.
120
6.1.3.
CODONPRAEFERENZEN
.
122
6.1.4.
D.
DISCOIDEUM-STAEMME
.
124
6.1.5.
GENE
.
126
6.2.
DIE
GENPRODUKTE
.
126
6.2.1.
CHROMATOGRAPHISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
ARTIFIZIELLEN
ANTIGENE
.
126
6.2.2.
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
DER
PROTEINASE
K
AUS
D.
DISCOIDEUM
.
127
6.2.3.
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
DER
PROTEINASE
K
AUS
E.
COLI
.
128
6.3.
BEWERTUNG
VON
D.
DISCOIDEUM
ALS
HETEROLOGES
EXPRESSIONSSYSTEM
.
128
7.
LITERATURVERZEICHNIS
130
8.
ABKUERZUNGEN
138
9.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
140
10.
LEBENSLAUF
UND
PUBLIKATIONEN
143 |
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| spelling | Kuschnick, Christine Maria Sylvia Verfasser aut Der niedere Eukaryont Dictyostelium discoideum als alternatives Expressionssystem eines in vitro synthetisierten Proteinase K Gens und zweier artifizieller Pseudomonas aeruginosa-Antigene von Christine Kuschnick 1999 IV, 144 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Frankfurt (Main), Univ., Diss., 1999 Antigen (DE-588)4002272-9 gnd rswk-swf Heterologe Genexpression (DE-588)4342015-1 gnd rswk-swf Proteinase K (DE-588)4175985-0 gnd rswk-swf Dictyostelium discoideum (DE-588)4012135-5 gnd rswk-swf Pseudomonas aeruginosa (DE-588)4047651-0 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Dictyostelium discoideum (DE-588)4012135-5 s Proteinase K (DE-588)4175985-0 s Heterologe Genexpression (DE-588)4342015-1 s DE-604 Pseudomonas aeruginosa (DE-588)4047651-0 s Antigen (DE-588)4002272-9 s DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009118565&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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