Einfluß der extrazellulären Matrix auf cerebrale kapilläre Endothelzellen: eine in-vitro-Studie
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 1
1 EINLEITUNG
-3
1.1 SCHRANKENSYSTEME IM GEHIRN 3
1.2 DIE BLUT-HIM-SCHRANKE (BHS) 4
1.2.1 DIE BHS
IN VIVO 4
1.2.1.1 AUFGABEN DER BHS 4
1.2.1.2 AUFBAU DER BHS 6
1.2.2 DIE BHS
IN VITRO 7
1.2.2.1 ENTWICKLUNG EINES BHS-ZELLKULTURSYSTEMS 7
1.2.2.2 INDUKTION DER BHS 8
1.3 ZELL-ZELL-KONTAKTE R 11
1.3.1 TIGHTJUNCTIONS 11
1.3.1.1 OCCLUDIN 13
1.3.1.2 CLAUDINE 14
1.3.1.3 JUNCTIONAL ADHESION MOLECULE (JAM) 14
1.3.1.4 TIGHT JUNCTION-ASSOZIIERTE PROTEINE: ZO-1 15
1.3.2 ADHERENSJUNCTIONS 17
1.4 DIE EXTRAZELLULAERE MATRIX (ECM) 18
1.4.1 POLYSACCHARIDE DER ECM 18
1.4.2 PROTEINE DER ECM 18
1.4.2.1 COLLAGEN TYP I 18
1.4.2.2 COLLAGEN TYP III 19
1.4.2.3 COLLAGEN TYP IV 19
1.4.2.4 FIBRONEKTIN . 21
1.4.2.5 LAMININ 23
1.4.2.6 NIDOGEN/ENTAKTIN 25
1.4.2.7 ANTIADHAESIVE ECM-MOLEKUELE:
TENASCIN, SPARC, THROMBOSPONDIN 25
1.5 DIE BASALMEMBRAN 27
1.5.1 AUFGABEN DER BASALMEMBRAN 27
1.5.2 KOMPONENTEN DER BASALMEMBRAN 28
1.6 INTEGRINE: ZELLREZEPTOREN DER ECM 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2 ZIELSETZUNG 34
3 METHODEN 35
3.1 PRAEPARATION CEREBRALER KAPILLAERER ENDOTHELZELLEN AUS SCHWEINEHIMEN
35
3.2 BESCHICHTUNG VON KULTURGEFAESSEN 37
3.2.1 BESCHICHTUNG VON ZELLKULTURFLASCHEN UND PETRISCHALEN 3 7
3.2.2 BESCHICHTUNG VON FILTEREINSAETZEN ^ 38
3.3 PASSAGE 39
3.4 IMPEDANZSPEKTROSKOPIE (IS) 40
3.4.1 DER TRANSENDOTHELIALE ELEKTRISCHE WIDERSTAND (TER) 41
3.4.2 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN 41
3.4.3 ERSATZSCHALTBILDER FUER DEN MESSAUFBAU UND DAS ELEKTROCHEMISCHE
SYSTEM 42
3.4.4 AUSWERTUNG DER IMPEDANZMESSUNGEN 44
3.5 MIKROSKOPISCHE METHODEN - 45
3.5.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 45
3.5.1.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG 46
3.5.1.2 FLUORESZENZMARKIERUNG VON FILAMENTOESEM AKTIN 49
3.5.2 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (TEM) 50
3.5.2.1 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE TEM 51
3.5.3 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE (REM) 53
3.5.3.1 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE REM 53
3.6 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 54
3.6.1 PROTEINISOLIERUNG 54
3.6.2 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 55
3.6.3 BICINCHONIN ACID-TEST (BCA-TEST) 57
4 ERGEBNISSE 59
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER BCEC
IN VITRO 59
4.2 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF COLLAGEN IV-, FIBRONEKTIN-
UND LAMININ-BESCHICHTUNGEN 61
4.2.1 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF COLLAGEN IV-BESCHICHTUNGEN 62
4.2.2 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF FIBRONEKTIN-BESCHICHTUNGEN 66
4.2.3 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF LAMININ-BESCHICHTUNGEN 70
4.3 AUSBILDUNG VON
TIGHT JUNCTION-PROTEINEN, DEM AKTIN-ZYTOSKELETT
UND FOKALKONTAKTEN AUF VERSCHIEDENEN BESCHICHTUNGEN 74
4.3.1 OCCLUDIN-NACHWEIS 74
4.3.2 CLAUDIN-1-NACHWEIS 74
4.3.3 ZO-1-NACHWEIS 75
4.3.4 AKTIN-NACHWEIS 75
4.3.5 NACHWEIS VON FOKALKONTAKTEN 75
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.4 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF DER ECM DES EHS-TUMORS 81
4.5 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF RATTENSCHWANZCOLLAGEN-
BESCHICHTUNGEN 82
4.6 CHARAKTERISIERUNG VON BCEC AUF UNTERSCHIEDLICHEN
ECM-BESCHICHTUNGEN IM VERGLEICH 83
4.7 BCEC AUF THROMBOSPONDIN-1 -BESCHICHTUNGEN -84
4.8 EXPRESSION VON ECM-MOLEKUELEN DURCH BCEC IN ABHAENGIGKEIT
VON DER VORGEGEBENEN BESCHICHTUNG 1 86
4.8.1 COLLAGEN IV-EXPRESSION 86
4.8.2 FIBRONEKTIN-EXPRESSION 87
4.8.3 LAMININ-EXPRESSION 87
4.9 EXPRESSION VON FIBRONEKTIN UND COLLAGEN IV IM VERGLEICH 91
4.9.1 FN-NACHWEIS AN NICHT PASSAGIERTEN BCEC 91
4.9.2 C IV-NACHWEIS AN NICHT PASSAGIERTEN BCEC 91
4.10 INTEGRIN-NACHWEIS AN BCEC - 94
4.11 VERGLEICH VON BCEC MIT UNTERSCHIEDLICH HOHEM TER 95
4.12 THROMBOSPONDIN-1 -EXPRESSION AN BCEC 97
4.12.1 TSP-1 -EXPRESSION NACH EINER VERLETZUNGSSIMULATION AN BCEC 97
4.12.2 TSP-1-EXPRESSION AN BCEC IN SUBKONFLUENTEM UND KONFLUENTEM
ZUSTAND 97
4.12.3 TSP-1 -EXPRESSION IM ZELLYSAT UND IM UEBERSTAND VON BCEC 100
5 DISKUSSION 104
5.1 CEREBRALE KAPILLAERE ENDOTHELZELLEN IN KULTUR 104
5.2 KULTIVIERUNG VON BCEC AUF COLLAGEN IV, FIBRONEKTIN-
UND LAMININ-BESCHICHTUNGEN 105
5.2.1 BCEC AUF COLLAGEN IV-BESCHICHTUNGEN 106
5.2.2 BCEC AUF FIBRONEKTIN-BESCHICHTUNGEN 107
5.2.3 BCEC AUF LAMININ-BESCHICHTUNGEN 108
5.3 EINFLUSS DER EXTRAZELLULAEREN MATRIX AUF ZELL-ZELL-KONTAKTE,
DAS AKTIN-ZYTOSKELETT UND FOKALKONTAKTE 109
5.4 BCEC KULTIVIERT AUF EHS-ECM UND RATTENSCHWANZCOLLAGEN 111
5.5 KULTIVIERUNG VON BCEC AUF VERSCHIEDENEN ECM-PROTEINEN
IM VERGLEICH 112
5.6 BCEC AUF THROMBOSPONDIN-1 KULTIVIERT 113
5.7 EXPRESSION VON FIBRONEKTIN UND COLLAGEN IV IN SERUMFREIEM UND
SERUMHALTIGEM MEDIUM 114
5.8 INTEGRIN-EXPRESSION AN BCEC 115
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.9 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN VON BCEC MIT
UNTERSCHIEDLICH HOHEM TER 115
5.10 EXPRESSION VON THROMBOSPONDIN-1 AN UNTERSCHIEDLICH
KONFLUENTEN BCEC 116
5.11 ZUSAMMENFASSENDE UEBERLEGUNGEN UND AUSBLICK
JA 8
6 ZUSAMMENFASSUNG 121
7 LITERATUR 122
8 ANHANG
134
8.1 CHEMIKALIEN ~ 134
8.2 ZELLKULTURMATERIALIEN 134
8.3 ANTIKOERPER UND FLUOROPHORE 135
8.4 VERBRAUCHSMATERIALIEN 136
8.5 GERAETE 136 |
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