Detektion und Differenzierung rebpathogener Phytoplasmen (Mollicutes, Eubacteria) in Deutschland unter Berücksichtigung phytopathologischer Aspekte:
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adam_text | DETEKTION UND DIFFERENZIERUNG REBPATHOGENER PHYTOPLASMEN (MOLLICUTES,
EUBACTERIA) IN DEUTSCHLAND UNTER BERUECKSICHTIGUNG PHYTOPATHOLOGISCHER
ASPEKTE DEM FACHBEREICH BIOLOGIE DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET DARMSTADT
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES EINES DOCTOR RERUM NATURALIUM
VORGELEGTE DISSERTATION VON WOLFGANG REINERT AUS NEUNKIRCHEN
BERICHTERSTATTER: PROF. DR. W. ULLRICH MITBERICHTERSTATTER: PROF. DR. E.
SEEMUELLER PROF. DR. K. NIXDORFF TAG DER EINREICHUNG: 20.09.1999 TAG DER
MUENDLICHEN PRUEFUNG: 16.11.1999 TECHNISCHE UNIVERSITAET DARMSTADT
FACHBEREICH 10 * BIOLOGIE * B IBL IOTHEK * SCHNITTSPAHNSTRASSE 10 D-6
4287 DARMSTADT INV.-NR.^B.... DARMSTADT 1999 INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGEN 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2 2.1 2.1.1 2.1.1.1
2.1.1.2 2.1.1.3 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.1.6 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.2.1
2.2.2.2 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3 2.2.3.4 EINLEITUNG PHYTOPLASMEN
UND PHYTOPLASMOSEN PHYTOPLASMAKRANKHEITEN DER REBE NACHWEIS VON
PHYTOPLASMEN IN REBEN BEKAEMPFUNG VON REBPHYTOPLASMOSEN AUSGANGSPUNKT UND
ZIELSETZUNG MATERIAL UND METHODEN MATERIAL REAGENZIEN RESTRIKTIONSENZYME
DNA-POLYMERASEN SONSTIGE REAGENZIEN VERBRAUCHSMATERIAL GERAETE
PFLANZENMATERIAL TIERMATERIAL VERGLEICHSSTAEMME VON PHYTOPLASMEN
PRAEPARATION VON PHYTOPLASMEN-DNA AUFARBEITUNG NACH DER CTAB-METHODE
PHYTOPLASMENANREICHERUNG DURCH ZENTRIFUGATION SACCHAROSEPUFFER
SORBITPUFFER ALTERNATIVE PRAEPARATIONSMETHODEN DIFFERENTIELLE
PRAEZIPITATION SDS-METHODE ABSORPTION AN DEAE-CELLULOSE KOMMERZIELLE
DNA-PRAEPARATIONSKITS 1 1 6 9 10 11 13 13 13 13 13 13 14 15 15 16 17 19
20 21 22 23 24 24 25 26 27 II 2.3 NACHWEIS UND DIFFERENZIERUNG VON
PHYTOPLASMEN 27 2.3.1 VISUELLE BONITUR INFIZIERTER STOECKE 27 2.3.2
PHYTOPLASMENNACHWEIS MITTELS PCR 28 2.3.3 PHYTOPLASMENNACHWEIS MITTELS
ELISA 31 2.3.3.1 ELISA MIT PHYTOPLASMEN VOM VK-TYP 32 2.3.3.2 ELISA MIT
PHYTOPLASMEN VONI AYG-TYP 32 2.3.4 PHYTOPLASMENNACHWEIS MITTELS IC-PCR
34 2.3.5 GENETISCHE DIFFERENZIERUNG DER AUS REBEN ISOLIERTEN
PHYTOPLASMEN 37 2.3.5.1 AMPLIFIKATION DES 16S RRNA-GENS 37 2.3.5.2
AMPLIFIKATION NICHTRIBOSOMALER FRAGMENTE 38 2.3.6 GELELEKTROPHORESE 39
2.3.6.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 39 2.3.6.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(PAGE) 40 2.3.6.3 GELDOKUMENTATION 41 2.4
VERSUCHE ZUR UEBERTRAGBARKEIT VON AYG 41 2.4.1 PFROPFUEBERTRAGBARKEIT VON
AYG AUF REBEN 41 2.4.1.1 TISCHVEREDLUNG 41 2.4.1.2 STANDORTVEREDLUNG 42
2.4.2 UEBERTRAGBARKEIT VON AYG DURCH SCAPHOIDEUS TITANUS 43 2.4.3
TRANSMISSIONSVERSUCHE MIT POTENTIELLEN VEKTOREN FUER AYG 44 2.5
SEQUENZIERUNG EINES NICHTRIBOSOMALEN DNA-FRAGMENTS AUS PHYTOPLASMEN DER
EY-GRUPPE 45 2.5.1 AMPLIFIKATION UND REINIGUNG DES NICHTRIBOSOMALEN
DNA-FRAGMENTS 45 2.5.2 HERSTELLUNG VON KLONIERTEN SONDEN 46 2.5.2.1
PLASMIDEXTRAKTION 46 2.5.2.2 VEKTORPRAEPARATION 47 2.5.2.3 LIGATION 48
2.5.2.4 TRANSFORMATION 48 2.5.2.5 ISOLIERUNG DER REKOMBINANTEN 49 2.5.3
DNA-SEQUENZANALYSE AUS MONIERTER DNA UND PCR-PRODUKTEN 49 2.6
ELIMINIERUNG DER PHYTOPLASMEN AUS INFIZIERTEN REBTEILEN MIT HILFE DER
THERMOTHERAPIE 50 2.6.1 HERKUNFT UND LAGERUNG DES BEHANDLUNGSGUTS 50
2.6.2 HEISSWASSERBEHANDLUNG VON REBMATERIAL 50 2.6.3 EINSCHULEN UND
BONITUR DER BEHANDELTEN REBEN 51 2.6.3.1 STECKLINGE 51 III 2.6.3.2
PFROPFREBEN 52 2.6.4 STATISTISCHE AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE 53 3
ERGEBNISSE 55 3.1 SYMPTOMAUSPRAEGUNG AN PHYTOPLASMENINFIZIERTEN REBEN 5 5
3.2 PRAEPARATION VON PHYTOPLASMEN-DNA 57 3.2.1 AUFARBEITUNG NACH DER
CTAB-METHODE 58 3.2.2 PHYTOPLASMENANREICHERUNG DURCH ZENTRIFUGATION 59
3.2.2.1 SACCHAROSEPUFFER 60 3.2.2.2 SORBITPUFFER 60 3.2.3 ALTERNATIVE
PRAEPARATIONSMETHODEN 61 3.2.4 DIE EFFIZIENZ DER UNTERSUCHTEN
PRAEPARATIONSMETHODEN IM VERGLEICH 62 3.3 NACHWEIS VON PHYTOPLASMEN MIT
MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODEN 63 3.3.1 NACHWEIS MIT HILFE DER PCR 63
3.3.2 NACHWEIS MIT HILFE DER IC-PCR 66 3.4 PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG VON AYG 69 3.4.1 PFROPFUEBERTRAGBARKEIT AUF REBEN 69
3.4.1.1 TISCHVEREDLUNG 69 3.4.1.2 STANDORTVEREDLUNG 70 3.4.2
UEBERTRAGBARKEIT DURCH SCAPHOIDEUS TITANUS 71 3.4.3 UEBERTRAGBARKEIT DURCH
ALTERNATIVE VEKTOREN 71 3.4.4 SEROLOGISCHER NACHWEIS VON AYG MIT HILFE
DES ELISA 74 3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON AYG UND VK
75 3.5.1 AMPLIFIKATION UND RESTRIKTIONSANALYSE RIBOSOMALER DNA 75
3.5.1.1 BREIT DETEKTIERENDE PRIMER 75 3.5.1.2 GRUPPENSPEZIFISCHE PRIMER
79 3.5.2 AMPLIFIKATION UND RESTRIKTIONSANALYSE NICHTRIBOSOMALER DNA 80
3.5.2.1 PHYTOPLASMEN DER EY-GRUPPE 80 3.5.2.2 PHYTOPLASMEN DER
STOLBUR-GRUPPE 83 3.5.3 SEQUENZANALYSE EINES NICHTRIBOSOMALEN
DNA-FRAGMENTS AUS PHYTOPLASMEN DES EY-CLUSTERS 86 3.6 ELIMINIERUNG DER
PHYTOPLASMEN AUS INFIZIERTEN REBTEILEN MIT HILFE DER THERMOTHERAPIE 93
3.6.1 EFFIZIENZ DER BEHANDLUNGSAPPARATUR 93 3.6.2 THERMOTHERAPIE MIT
AUSGANGSMATERIAL FUER STECKLINGE 94 IV 3.6.2.1 AUSWIRKUNGEN AUF DEN
AUSTRIEB 94 3.6.2.2 EFFIZIENZ DER METHODE 95 3.6.3 THERMOTHERAPIE MIT
AUSGANGSMATERIAL FUER PFROPFREBEN 97 3.6.3.1 AUSWIRKUNGEN AUF DEN
AUSTRIEB 97 3.6.3.2 PHYTOSANITAERE EFFIZIENZ DER THERMOTHERAPIE 99 4
DISKUSSION 100 4.1 NACHWEIS VON PHYTOPLASMEN IN INFIZIERTEN REBEN UND
ZIKADEN 100 4.1.1 NACHWEIS DURCH PCR 100 4.1.2 IC-PCR ALS KOMBINATION
AUS PRAEPARATIONS- UND NACHWEISMETHODE 103 4.2 DIFFERENZIERUNG DER MIT
REBEN ASSOZIIERTEN PHYTOPLASMEN 105 4.2.1 SYMPTOMAUSPRAEGUNG AN STOECKEN,
DIE MIT VK ODER AYG INFIZIERT SIND 105 4.2.2 CHARAKTERISIERUNG UND
DIFFERENZIERUNG VON AYG 105 4.2.2.1 PFROPFUEBERTRAGBARKEIT UND
PFROPFUEBERTRAGUNG VON AYG 105 4.2.2.2 VEKTORUEBERTRAGBARKEIT UND
VEKTORUEBERTRAGUNG VON AYG 106 4.2.2.3 SEROLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON
AYG 109 4.2.2.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON AYG ANHAND
DER 16S RDNA 109 4.2.2.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON AYG
ANHAND EINES NICHTRIBOSOMALEN DNA-FRAGMENTS 110 4.2.3 CHARAKTERISIERUNG
VON REBPATHOGENEN PHYTOPLASMEN DER STOLBUR-GRUPPE 112 4.3 ELIMINIERUNG
DER PHYTOPLASMEN AUS INFIZIERTEN REBTEILEN MIT HILFE DER THERMOTHERAPIE
113 4.3.1 THERMOTHERAPIE AN STECKLINGEN 114 4.3.2 THERMOTHERAPIE AN
PFROPFREBEN 116 5 ZUSAMMENFASSUNG 118 6 LITERATUR 120 ANHANG 138
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