Expression und asymmetrische Transporteigenschaften des Natrium-D-Glucose Kotransporters aus der Kaninchenniere in sekretorischen Vesikeln von Saccharomyces cerevisiae NY17:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. ZUSAMMENFASSUNG
2. ABKUERZUNGEN
3. EINLEITUNG
4. MATERIAL UND METHODEN
4.1. MATERIALIEN UND REAGENZIEN
4.2. MIKROBIOLOGISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN
4.2.1. GENETISCHE EIGENSCHAFTEN DES STAMMES S.
CEREVISIAE NY17
4.2.2. NAEHRMEDIEN FUER S.
CEREVISIAE NY17
4.2.3. KULTIVIERUNG VON S. CEREVISIAE NY17 UND EXPRESSIONSKONTROLLE
4.2.4. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS S. CEREVISIAE NY17
4.2.5. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI _
4.2.6. REINHEITS- UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER DNA
4.2.7. SPALTUNG VON DNA MIT TYP N-RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
4.2.8. ANALYSE DER DNA DURCH AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
4.2.9. ISOLIERUNG DER GESPALTENEN DNA-FRAGMENTE AUS AGAROSEGELEN
4.2.10. DEPHOSPHORYLIERUNG UND LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN
4.2.11. TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN S.
CEREVISIAE NY17
4.2.12. PRAEPARATION DER TRAEGER-DNA
4.2.13. TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN E.
COLI
4.2.14 NICHT RADIOAKTIVE DNA-SEQUENZIERUNG
4.2.15. NORTHERN BLOT
4.3. ZELLBIOLOGISCHE UND PROTEINCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN
4.3.1. ISOLIERUNG DER MIKROSOMALEN MEMBRANFRAKTION AUS S.
CEREVISIAE NY17
4.3.1.1. ISOLIERUNG NACH ENZYMATISCHEM AUFSCHLUSS DER HEFEZELLWAND
4.3.1.2. ISOLIERUNG NACH MECHANISCHEM AUFSCHLUSS DER HEFEZELLWAND
4.3.2. GRADIENTEN ZUR AUFREINIGUNG DER MIKROSOMALEN MEMBRANFRAKTION
4.3.2.1. AUFREINIGUNG MIT HILFE EINES DISKONTINUIERLICHEN
DICHTEGRADIENTEN
4.3.2.2. AUFREINIGUNG MIT HILFE EINES KONTINUIERLICHEN DICHTEGRADIENTEN
4.3.3. PROTEINBESTIMMUNG
4.3.4. SDS-POLYACRYLAMIDGEIELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
4.3.5. WESTERN BLOT
4.3.6. AKTIVITAETSTEST DER VANADAT-HEMMBAREN H+-ATPASE
4.3.7. AKTIVITAETSTEST DER INVERTASE
4.3.8. FLUORESZENZMESSUNGEN
4.3.9. TRANSPORTMESSUNGEN
1
4
6
14
14
14
14
15
15
16
16
17
17
18
18
19
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20
21
22
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23
23
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26
26
27
28
29
29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
4.3.9.1. TRANSPORTSTUDIEN AN HEFEZELLEN 29
4.3.9.2. SUBSTRATAUFNAHME DURCH MEMBRANFRAKTIONEN (INFLUXEXPERIMENTE) 30
4.3.9.3. SUBSTRATAUSTRITT AUS DEN MEMBRANFRAKTIONEN (EFFLUXEXPERIMENTE)
30
4.3.10. STATISTIK
31
5.
ERGEBNISSE ' 32
5.1. EXPRESSION DES SGLT1 IN S.
CEREVISIAE NY17 32
5.1.1. DER EXPRESSIONSVEKTOR PYEDP SGLT1
32
5.1.2. NACHWEIS DER TRANSKRIPTION VON SGLT 1 AUF MRNA-FEBENE 33
5.1.3. NACHWEIS DER EXPRESSION VON SGLT 1 AUF PROTEINEBENE 35
5.1.4. ABHAENGIGKEIT DER WACHSTUMSKURVE VON DER RESTRIKTIVEN TEMPERATUR
39
5.1.5. NACHWEIS DER FUNKTIONELLEN AKTIVITAET DES SGLT 1 NACH EXPRESSION
IN
S. CEREVISIAE NY17 41
5.1.6. IMMUNOLOKALISATION DES SGLT1 IN S.
CEREVISIAE NY17 42
5.2. ANREICHERUNG DER SEKRETORISCHEN VESIKEL AUS S.
CEREVISIAE NY17 44
5.2.1. AUFSCHLUSS DER HEFE UND ISOLIERUNG DER MIKROSOMALEN
MEMBRANFRAKTION 44
5.2.2. FLUORESZENZMESSUNGEN ZUR UEBERPRUEFUNG DER INTEGRITAET DER
MIKROSOMEN 47
5.2.3. INDIREKTE QUANTIFIZIERUNG DES SGLT1 IN DER MIKROSOMALEN FRAKTION
49
5.2.4. TRENNUNG DER MIKROSOMEN UEBER EINEN DISKONTINUIERLICHEN
DICHTEGRADIENTEN 50
5.2.5. TRENNUNG DER MIKROSOMEN UEBER EINEN KONTINUIERLICHEN
DICHTEGRADIENTEN 53
5.3. TRANSPORTEIGENSCHAFTEN DES SGLT1 IN SEKRETORISCHEN VESIKELN 56
5.3.1. PILOTEXPERIMENTE
56
5.3.2. EFFLUXEXPERIMENTE
59
5.3.2.1. EINFLUSS VON NATRIUM, KALIUM UND PHLORIZIN AUF DEN
GLUCOSEAUSTRITT 59
5.3.2.2. EINFLUSS DER GLUCOSEJCONFIGURATION AUF DEN GLUCOSEAUSTRITT 60
5.3.2.3. EINFLUSS DER POTENTIALDIFFERENZ AUF DEN GLUCOSEAUSTRITT 61
5.3.3. INFLUXEXPERIMENTE
33
5.3.3.1. EINFLUSS VON NATRIUM UND KALIUM AUF DIE GLUCOSEAUFNAHME 63
5.3.3.2. EINFLUSS VON PHLORIZIN AUF DIE GLUCOSEAUFNAHME 65
5.3.3.3. TEMPERATURABHAENGIGKEIT DER GLUCOSEAUFNAHME 66
5.3.3.4. EXPRESSION EINER NICHT TRANSPORTAKTIVEN SGLT1-MUTANTE 67
5.3.3.5. D-GLUCOSE-AFFINITAET DER INTRAZELLULAEREN SEITE DES SGLT 1 71
5.3.3.6. STEREOSELEKTIVITAET DER INTRAZELLULAEREN SEITE DES SGLT1 73
5.3.3.7. EINFLUSS VON MTSET AUF DIE GLUCOSEAUFNAHME 74
6. DISKUSSION *8
7. LITERATURVERZEICHNIS 91
8. DANKSAGUNG 99 |
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