Bedeutung des C-Terminus von Sulfonylharnstoffrezeptoren für die Bindung von Sulfonylharnstoffen und Kalium-Kanal-Öffnern:
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2000
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BEDEUTUNG DES C-TERMINUS VON
SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN FUER DIE BINDUNG VON SULFONYLHARNSTOFFEN UND
KALIUM-KANAL-OEFFNERN
VON DER GEMEINSAMEN NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER TECHNISCHEN
UNIVERSITAET CAROLO-WILHELMINA ZU BRAUNSCHWEIG ZUR ERLANGUNG DES GRADES
EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE
D I S S E R T A T I ON
VON
HENRIK DOERSCHNER
AUS
WOLFSBURG
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN V
1 EINLEITUNG L
1.1 ATP-SENSITIVE KALIUMKANAELE 1
1.1.1 K AT P-KANAELE IN B-ZELLEN 1
1.1.2 KFJP-KANAELE IN NEURONEN 2
1.1.3 K/AF-KANAE LE IN HERZ UND SKELETTMUSKEL 3
1.1.4 KATP-KANAELE IN GLATTER MUSKULATUR 3
1.1.5 STRUKTUR VON K^JP-KANAELEN 4
1.2 SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN 5
1.2.1 EINFUEHRUNG 5
1.2.2 SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN SIND ABC-CASSETTENPROTEINE 5
1.2.3 KLONIERUNG DER SULFONYLHARNSTOFFREZEPTOREN 6
1.2.4 PHHI ALS FOLGE REDUZIERTER OFFEN-WAHRSCHEINLICHKEIT VON
SUR1/K, R 6.2-KANAELEN 7
1.3 MODULATOREN DER K A TP-KANALAKTIVITAET 7
1.3.1 SULFONYLHARNSTOFFE 1
1.3.1.1 THERAPIE DES TYP-H-DIABETES 7
1.3.1.2 ENTWICKLUNG 8
1.3.1.3 WIRKMECHANISMUS 10
1.3.2 KALIUM-KANAL-OEFFNER 12
1.3.2.1 EINFUEHRUNG 12
1.3.2.1.1 DIAZOXID 13
1.3.2.1.2 PINACIDIL 13
1.3.2.1.3 WEITERE KALIUM-KANAL-OEFFNER 14
1.3.2.2 THERAPEUTISCHES POTENTIAL 14
1.3.2.3 IDENTIFIZIERUNG DER REZEPTORBINDUNGSSTELLE FUER KCOS 15
2 ZIELE DER ARBEIT 17
3 MATERIAL UND METHODEN 18
3.1 KULTIVIERUNG, PASSAGIERUNG UND KONSERVIERUNG VON COS7-ZELLEN 18
I
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1 LOESUNGEN UND MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR 18
3.1.2 KULTIVIERUNG VON COS / -ZELLEN 19
3.1.3 UMSETZEN DER ZELLEN (PASSAGIEREN) 19
3.1.4 KRYOKONSERVIERUNG VON COS / -ZELLEN 20
3.2 HERSTELLUNG DER MUTATIONEN 20
3.2.1 LOESUNGEN FUER DIE MUTATIONEN 20
3.2.2 OVERLAP-EXTENSION-POLYMERASEKETTENREAKTION 21
3.2.3 AUFTRENNUNG UND REINIGUNG DES PCR-PRODUKTS 21
3.2.4 VERDAU UND LIGATION VON PCR-PRODUKT UND SUR 22
3.3 TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 22
3.3.1 LOESUNGEN FUER DIE TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 22
3.3.2 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN 25
3.3.3 DURCHFUEHRUNG DER TRANSFORMATION 26
3.3.4 PLASMIDPRAEPARATION 26
3.3.5 SEQUENZIERUNG 27
3.4 TRANSFEKTION 27
3.4.1 LOESUNGEN FUER DIE TRANSFEKTION 27
3.4.2 TRANSFEKTION MITTELS DEAE-DEXTRAN-METHODE 29
3.5 MEMBRANPRAEPARATION 30
3.5.1 LOESUNGEN FUER DIE MEMBRANPRAEPARATION 30
3.5.2 PRAEPARATION VON MEMBRANEN AUS COS7-ZELLEN 30
3.6 PROTEINBESTIMMUNG 31
3.6.1 LOESUNGEN FUER DIE PROTEINBESTIMMUNG 31
3.6.2 DURCHFUEHRUNG DER PROTEINBESTIMMUNG 31
3.7 BINDUNGSEXPERIMENTE AN COS7-MEMBRANEN 32
3.7.1 LOESUNGEN FUER DIE BINDUNGSEXPERIMENTE 32
3.7.1.1 LOESUNGEN DER RADIOLIGANDEN 32
3.7.1.2 STAMMLOESUNGEN DER EINGESETZTEN TESTSUBSTANZEN 32
3.7.1.3 LOESUNGEN DER NUKLEOTIDE 34
3.7.1.4 LOESUNGEN FUER VERSUCHE MIT HEXOKINASE UND GLUCOSE 35
3.7.1.5 LOESUNGEN FUER VERSUCHE MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 35
3.7.2 VORBEREITUNG DER MEMBRANEN 35
3.7.3 GLEICHGEWICHTSBINDUNGSEXPERIMENTE 35
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.3.1 3.7.3.2
3.7.3.3
PRINZIP DES FILTRATIONSASSAYS INKUBATIONEN
FILTRATION UND SZINTILLATIONSZAEHLUNG
3.8 DATENAUSWERTUNG
3.8.1
3.8.2
3.8.3
3.8.4
3.8.5
3.8.6
3.8.7
STATISTIK
SPEZIFISCHE BINDUNG
KINETIKEN
GLEICHGEWICHTSBINDUNG
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
ZAHL DER REZEPTOREN
BERECHNUNG DER THEORETISCHEN KONZENTRATIONS-HEMM-BEZIEHUNGEN
4 ERGEBNISSE
4.1 ETABLIERUNG EINES VERFAHRENS ZUR ZIELGERICHTETEN MUTAGENESE 4.1.1
4.1.2
4.1.3
EINFUEHRUNG
PRINZIP DER OVERLAP-EXTENSION-PCR
EINBAU DES MUTIERTEN PCR-PRODUKTS IN DIE CDNA DES SUR
35 36 36
37
37
37
37
38
38
40
40
43
43
43
43
46
4.1.4 BEISPIEL 1: EINFUEHRUNG EINER RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLE IN DIE CDNA
DES HUMANEN SUR2B DURCH EINE * STILLE MUTATION 48
4.1.5 BEISPIEL 2: MUTATION DER ASPARAGINSAEURE AN POSITION 1544 DES
RATTEN SUR2B IN EIN ASPARAGIN (D1544N) 52
4.2 REGULATION DES REKOMBINANTEN SUR2B DER RATTE 57
4.2.1 NUKLEOTIDE 57
4.2.1.1 EINFLUSS VON MGATP AUF DIE BINDUNG VON KALIUM-KANAL-OEFFNERN 57
4.2.1.2 KINETIKEN FUER DIE ASSOZIATION VON P1075 58
4.2.1.3 ALKALISCHE PHOSPHATASE INDUZIERT EINE BESCHLEUNIGUNG DER
DISSOZIATION 61
4.2.1.4 EINFLUSS WEITERER HYDROLYSIERBARER NUKLEOSIDDI- UND -TRIPHOSPHATE
62
4.2.1.5 EFFEKTE SYNTHETISCHER NUKLEOTIDANALOGA 65
4.2.2 EINFLUSS DIVALENTER KATIONEN AUF DIE BINDUNG VON P1075 67
4.3 , BEDEUTUNG DES C-TERMINUS FUER DIE BINDUNG VON K +
-KANAL-MODULATOREN UND
DIE REGULATION DURCH ATP 70
4.3.1 CHARAKTERISIERUNG VON SUR2-ISOFORMEN 70
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.1.1 KALIUM-KANAL-OEFFNER 70
4.3.1.2 EINFLUSS VON PUNKTMUTATIONEN IM C-TERMINUS VON SUR2B AUF DIE
BINDUNG VON KCOS 73
4.3.1.3 MINOXIDILSULFAT 76
4.3.1.4 K/ITP-KANAL-BLOCKIERENDE SUBSTANZEN 77
4.3.2 EINFLUSS VON C-TERMINALEN DELETIONEN IN SUR1 AUF DIE BINDUNG
VON SULFONYLHARNSTOFFEN UND KCOS 80
4.3.2.1 GLIBENCLAMID 80
4.3.2.2 DIAZOXID 81
4.3.2.3 EFFEKT C-TERMINALER DELETIONEN AUF DEN ATP-INDUZIERTEN
KONFORMATIONSWECHSEL VON SUR1 84
5 DISKUSSION 87
5.1 REGULATION DER KCO-BINDUNG AM SUR2B DER RATTE DURCH NUKLEOTIDE 87
5.1.1 DER A TP-INDUZIERTE KONFORMATIONSWECHSEL DES SUR2B IST NUR
LANGSAM REVERSIBEL 87
5.1.2 INDUKTION DES KCO-BINDENDEN ZUSTANDS DURCH ANDERE NUKLEOTIDE
UND SYNTHETISCHE NUKLEOTIDANALOGA 88
5.2 DER C-TERMINUS IST KRITISCH FUER DIE ATP-INDUZIERTE
KONFORMATIONSAENDERUNG
UND DIE BINDUNG VON KCOS 90
5.2.1 EINFLUSS DES C-TERMINUS VON SUR2 AUF DIE BINDUNG VON KALIUM-
KANAL-MODULATOREN 90
5.2.2 DELETIONEN AM C-TERMINUS VERHINDERN DAS SCHALTEN VON SUR1 IN
DIE KCO-BINDENDE *ON -KONFORMATION 92
5.3 STOECHIOMETRIE DER SULFONYLHARNSTOFF-INDUZIERTEN KATP-KANAL-BLOCKADE
93
6 ZUSAMMENFASSUNG 99
7 LITERATURVERZEICHNIS 102
RV
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| topic_facet | Carboxylterminus Sulfonylharnstoffderivate Sulfonylharnstoffrezeptor Kalium-Kanalöffner Hochschulschrift |
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