Zelltypspezifische Genexpression und Proteinstabilität bei Dictyostelium discoideum:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
ZUSAMMENFASSUNG
.
6
II.
EINLEITUNG
.
8
1
DAS
SYSTEM
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
.
8
1.1
ZELLTYPEN
BEI
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
.
9
1.2
ZELLTYPSPEZIFISCHE
GENE
BEI
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
.
11
1.2.1
PRESPORE-SPEZIFISCHE
GENE
.
11
1
2.2
PRESTALK-SPEZIFISCHE
GENE
.
11
1.3
MUSTERBILDUNGSMECHANISMEN
.
12
1.3.1
AUSSORTIERUNG
.
13
1.3.2
POSITIONSABHAENGIGE
DIFFERENZIERUNG
.
14
1.3.3
MOEGLICHE
EXTRAZELLULAERE
DIFFERENZIERUNGSSIGNALE
.
15
2
FRAGESTELLUNG
.
16
2.1
DER
UBIQUITIN-VERMITTELTE
PROTEINABBAU
UND
DIE
N-END-RULE
.
17
2.2
VORSTELLUNG
DER
ARBEITSHYPOTHESE
.
18
III.
ERGEBNISSE
1
KONSTRUKTION
DER
VERSCHIEDENEN
DD-VEKTOREN
.
20
1.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
VERSCHIEDENEN
KONSTRUKTE
.
20
1.1.1
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DIE
REPORTERGENKONSTRUKTE
.
20
1.1.2
TRANSFORMATION
UND
KLONIERUNG
VON
DD
.
23
2
MESSUNGEN
DER
REPORTERPROTEIN-HALBWERTSZEIT
BEI
DD
.
23
2.1
PRESPORE-SPEZIFISCHE
SS-GALAKTOSIDASE-KONSTRUKTE
.
24
2.1.1
ABBAUEXPERIMENT
MIT
COFFEIN
.
24
2.1.2
AKKUMULATIONSEXPENMENT
.
27
2.1.3
IN-VIVO-TEST
DER
REPORTERSTABILITAET
.
31
2.1.4
UNTERSUCHUNG
DER
NORMALEN
PSA-EXPRESSION
MIT
HILFE
STABILER
UND
LABILER
REPORTER
.
34
2.2
PRESTALK-SPEZIFISCHE
SS-GALAKTOSIDASE-KONSTRUKTE
.
39
2.2.1
ECMA-GA/-KONSTRUKTE
.
39
2.2.2
ECMS-GA/-KONSTRUKTE
.44
2.3
GREEN
FLUORESCENT
PROTEIN-KONSTRUKTE
.46
2.3.1
ABBAUEXPERIMENT
MIT
COFFEIN
.
47
2.3.2
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
49
2.3.3
IN-VIVO-TEST
DER
REPORTERSTABILITAET
.
52
2.3.4
EXPRESSIONSMUSTER
IN
DER
PRESPORE
UND
PRESTALK-ZONE
.
54
IV.
DISKUSSION
1
DIE
N-END-RULE
IN
DD
.
56
1.1
STABILITAET
DES
REPORTERPROTEINS
SS-GALAKTOSIDASE
IN
DD
.
56
1.2
ALLGEMEINGULTIGKEIT
DER
N-END-RULE
.
59
1.3
STABILITAET
DES
REPORTERPROTEINS
GFP
IN
DD
.
61
2
MUSTERBILDUNG
.
62
2.1
PRESPORE-IIKE-ZELLEN
(PLC)
.
64
2.2
MUSTERBILDUNG
INNERHALB
DER PRESPORE-ZONE
.
64
2.3
MUSTERBILDUNG
INNERHALB
DER
PRESTALK-ZONE
.
66
2.3.1
ECMB
.
66
2.3.2
ECMA
.
67
2.4
LOKALE
SIGNALE
UND
AUSSORTIERUNG
ALS
MECHANISMEN
DER
MUSTERBILDUNG
.
71
5
3
AUSBLICK
.
74
V.
MATERIAL
UND
METHODEN
1
MATERIAL
.
75
1.1
ZELLMATERIAL
.
78
1.2
LOESUNGEN,
PUFFER,
MEDIEN
.
79
2
METHODEN
.
85
2.1
ARBEITEN
MIT
DD-ZELLEN
.
85
2.1.1
ANZUCHT
VON
DD-ZELLEN
AUF
AGARPLATTEN
.
85
2.1.2
ANZUCHT
VON
DD-ZELLEN
IN
SUSPENSION
.
86
2.1.3
KONSERVIERUNG
DER
STAEMME.
86
2.1.4
ENTWICKLUNG
DER
DD-ZELLEN
.
86
2.1.5
TRANSFORMATION
VON
DD-ZELLEN
.
86
2.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
87
2.2.1
KOMPETENZINDUKTION
BEI
XL
BLUE/GM
174/DH5A
.
87
2.2.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
87
2.2.3
MINI-PRAEPARATION
PLASMID-DNA
.
87
2.2.4
MAXI-PRAEPARATION
PLASMID-DNA
.
88
2.2.5
KONSERVIERUNG
DER
TRANSFORMIERTEN
BAKTERIEN
.
88
2.2.6
RESTRIKTIONSVERDAU
.
89
2.2.7
GELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
DER
DNA
.
89
2.2.8
RESTRIKTIONSFRAGMENTE
DER
X-DNA
.
89
2.2.9
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
.
89
2.2.10
LIGATIONEN
.
90
2.2.11
OLIGONUKLEOTID-REINIGUNG
UND
BESTIMMUNG
DER
OD
.
90
2.2.12
POLYMERASE-CHAIN
REACTION
(PCR)
.
91
2.2.13
NACHBEHANDLUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
.
91
2.2.14
LTGTEREN
VON
PCR-FRAGMENTEN
.
92
2.2.15
SEQUENZANALYSE
.
92
2.3
ANALYSE
TRANSGENER
DD-ZELLEN
.
94
2.3.1
COLONY-BLOT
ZUM
TRANSFORMANTEN-SCREENING
.
94
2.3.2
GALAKTOSIDASE-NACHWEIS
.
94
2.3.3
GREEN-FLUORESCENT-PROTEIN-NACHWEIS
.
94
2.3.4
COFFEIN-SCHUETTELEXPERIMENT
.
95
2.3.5
CAMP-SCHUETTELEXPERIMENT
.
95
2.3.6
PROTEINBESTIMMUNG
.
95
2.3.7
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
95
2.3.8
WESTERN
BLOTTING
.
96
2.3.9
COOMASSIE-FAERBUNG
IM
PROTEINGEL
.
96
VI.
LITERATUR
.
97
VII.
ANHANG
.
105 |
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