Charakterisierung von neuen Zellkernproteinen, die an der Regulation des alternativen Spleißens beteiligt sind:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
UND
FACHAUSDRUECKE
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
.
2.
EINLEITUNG
.
2.1
DIE
ORGANISATION
DER
GENEXPRESSION
IM
ZELLKERN
.
2.2
PRAE-MRNA
SPLEISSEN
.
23
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
.
2.4
REGULATIONSMECHANISMEN
BEIM
ALTERNATIVEN
SPLEISSEN
.
2.4.1
DIE
RNA
SEQUENZINFORMATION
.
2.4.2
DIE
REGULATION
DES
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
DURCH
PROTEINE
.
2.4.2.1
REGULATION
DES
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
DURCH
RS-DOMAENEN
PROTEINE
.
2.4.2.2
DIE
REGULATION
DES
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
DURCH
HNRNP'S
.
2.4.3
DIE
REGULATION
DES
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
DURCH
(EXTRA-)ZELLULAERE
SIGNALE.
2.5
SIGNALTRANSDUKTION
.
2.6
SAM68
(68
KDA
SRC
SUBSTRATE
ASSOCIATED
DURING
MITOSIS)
.
2.6.1
SAM68:
EINE
INTEGRATIONSSTELLE
FUER
VERSCHIEDENE
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE?
.
2.6.2
DIE
BIOLOGISCHE
FUNKTION
VON
SAM68
.
2.6.3
SAM68
IST
EIN
MITGLIED
DER
STAR
FAMILIE
.
2.7
ZIELSETZUNG
.
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
3.1
MATERIAL
.
3.1.1
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
3.1.2
ENZYME
.
3.1.3
RADIOCHEMIKALIEN
.
3.1.4
GERAETE
.
3.1.5
TIERE
.
3.1.6
ZELLINIEN
.
3.1.7
BAKTERIENSTAEMME
.
3.1.8
HEFESTAMM
.
3.1.9
OLIGONUKLEOTIDE
.
3.1.10
PLASMIDE
.
3.1.11
PEPTIDE
.
3.1.12 ANTIKOERPER
.
3.1.13
ZWEI-HYBRID-CDNA-BANKEN
.
3.1.14
MINIGENE
.
3.1.15
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
3.1.16
MEDIEN
.
I
VI
1
2
2
3
4
5
5
5
5
7
8
9
10
10
11
11
12
14
14
14
15
15
16
16
16
17
17
17
21
24
24
25
26
28
28
INHALTSVERZEICHNIS
3.2
METHODEN
.
29
3.2.1
KLONIERUNG
.
29
3.2.1.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
UND
TRANSFORMATION
.
29
3.2.1.2
PLASMID-PRAEPARATION
.
29
3.2.1.3
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREKONZENTRATIONEN
.
30
3.2.1.4
DIE
HYDROLYSE
UND
REINIGUNG
VON
DNA
.
30
3.2.1.5
LIGATION
.
31
3.2.2
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
31
3.2.3
DIE
ANALYSE
DER
CHROMOSOMALEN
LOKALISATION
.
31
3.2.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
32
3.2.5
SOUTHERN
BLOT
UND
HYBRIDISIERUNG
MIT
EINER
RADIOAKTIVEN
SONDE
.
33
3.2.6
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
.
33
3.2.7
METHODEN
DER
ZELLKULTUR
.
34
3.2.7.1
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
.
34
3.2.7.2
TRANSFORMATION
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
.
34
3.2.8
RNA-METHODEN
.
35
3.2.8.1
ISOLIERUNG
VON
RNA
.
35
3.2.8.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
35
3.2.8.3
RT-PCR
.
36
3.2.8.4
IN
VIVO
SPLEISSVERSUCHE
.
36
3.2.8.5
IN
VITRO
SPLEISSVERSUCHE
.
37
3.2.8.5.
1
GEWINNUNG
VON
HELA
ZELLKEMEXTRAKT
.
37
3.2.8.5.2
GEWINNUNG
DES
SLOO-EXTRAKTS
.
37
3.2.8.5.3
DIE
SPLEISSREAKTION
MIT
DEM
D16-SUBSTRAT
.
38
3.2.8.6
5
'
RACE
.
38
3.2.8.7
NORTHERN
BLOT
.
39
3.2.9
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
40
3.2.9.1
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
NATIVEM,
REKOMBINANTEM
GST
RSLM-2
UND
HIS-NOP30
.
40
3.2.9.2
GEWINNUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
GEWEBE
.
41
3.2.9.3
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
41
3.2.9.4
BESTIMMUNG
DER
PROTEIN-KONZENTRATIONEN
NACH
BRADFORD
.
43
3.2.9.5
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
.
43
3.2.9.6
AFFINITAETSREINIGUNG
DER
ANTIKOERPER
.
43
3.2.9.7
COOMASSIEFAERBUNG
.
44
3.2.9.8
INUNUNOHISTOCHEMIE
.
45
3.2.10
DETEKTION
VON
PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
.
45
3.2.10.1
DAS
HEFE
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
.
45
3.2.10.1.1
THEORETISCHE
GRUNDLAGEN
.
45
3.2.10.1.2
ZWEI-HYBRID-ANALYSE
.
46
3.2.10.1.3
DER
BETA-GALAKTOSIDASE
TEST
.
47
3.2.10.1.4
PLASMIDISOLIERUNG
BEI
HEFEN
.
47
3.2.10.2
CO-IMMUNOPRAEZIPITATIONEN
.
48
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.10.3
PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
IN
VITRO
.
49
3.2.11
DETEKTION
VON
PROTEIN-RNA-WECHSELWIRKUNGEN
.
50
3.2.11.1
ARBEITEN
MIT
AN
AGAROSE
IMMOBILISIERTER
RNA
.
50
3.2.11.2
GELRETARDATINSVERSUCHE
.
50
4.
ERGEBNISSE
.
52
4.1
RSLM-2
KOPPELT
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
AN
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADEN.
52
4.1.1
NEUE
INTERAKTOREN
VON
RS
AF-B
.
52
4.1.2
DIE
DNA
UND
PROTEINSEQUENZ
VON
RSLM-2
.
52
4.1.3
DIE
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
VON
RSLM-2
.
54
4.1.4
IDENTIFIZIERUNG
VON
RSLM-2-INTERAKTOREN
MIT
DEM
ZWEI-HYBRID
SYSTEM.
.
56
4.1.5
DIE
SUCHE
NACH
INTERAKTOREN
VON
RSAM68*
MIT
DEM
ZWEI-HYBRID
SYSTEM.
57
4.1.6
DIE
SEQUENZ
DER
STAR
PROTEINE
RSAM68
UND
RSLM-1
.
58
4.1.7
DIE
SUCHE
NACH
INTERAKTOREN
VON
RSLM
1
MIT
DEM
ZWEI-HYBRID
SYSTEM.
.
62
4.1.8
UNTERSUCHUNG
DER
BEOBACHTETEN
INTERAKTIONEN
AUF
IHRE
REPRODUZIERBARKEIT.
63
4.1.9
UNTERSUCHUNG
DER
DELETIONSVARIANTEN
VON
RSLM-2
IM
ZWEI-HYBRID
SYSTEM
.
63
4.1.10
DIE
ERZEUGUNG
UND
UNTERSUCHUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
RSLM-1
UND
RSLM-2
.
64
4.1.11
DIE
BESTAETIGUNG
DER
IM
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
BEOBACHTETEN
WECHSELWIRKUNGEN
VON
RSLM-2
MIT
HILFE
VON
COIMMUNOPRAEZIPITATIONEN
66
4.1.12
DIE
INTERAKTION
VON
RSLM-2
MIT
SPLEISSFAKTOREN
.
68
4.1.12.1
RSLM-2
INTERAGIERT
MIT
SRP30C
IM
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
.
68
4.1.12.2
RSLM-2
BILDET
EINEN
KOMPLEX
MIT
SPLEISSFAKTOREN
IN
VIVO
.
68
4.1.13
DIE
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEM
RSLM-2
PROTEIN
.
70
4.1.14
DIE
ANALYSE
VON
PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
IN
VITRO
.
71
4.1.15
IN
VIVO
SPLEISSVERSUCHE
.
72
4.1.15.1.
MINIGENE
.
72
4.1.15.2
DER
EINFLUSS
VON
RSLM-2
AUF
DAS
EXON
V5
DES
CD44-MINIGENS.
.
73
4.1.15.3
DER
EINFLUSS
DER
RSLM-2-INTERAKTOREN
SAF-B,
SRP30C
UND
HTRA2BETAL
AUF
DAS
CD44V5
MINIGEN
.
75
4.1.15.4
DER
EINFLUSS
VON
RSLM-2
AUF
DAS
HTRA2BETA-MINIGEN
.
75
4.1.16
DIE
RNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
RSLM-2
.
76
4.1.16.1
DIE
BINDUNG
VON
UEBEREXPRIMIERTEM
RSLM-2
UND
RSLM-1
AN
HOMOPOLYMERE
RNA
.
76
4.1.16.2
DIE
BINDUNG
VON
REKOMBINANTEM
OST-RSLM-2
AN
PURINHALTIGE
RNA
.
78
4.1.17
DER
EINFLUSS
VON
RSLM-2
AUF
DAS
ALTERNATIVE
SPLEISSEN
IN
VITRO
.
79
4.1.18
DIE
ANALYSE
DER
RSLM
1
-
UND
RSLM-2-EXPRESSION
IM
NORTHEM-BLOT
.
80
4.1.19
DIE
ANALYSE
DER
RSLM-2-PROTEIN
EXPRESSION
MIT
HILFE
DER
IMMUNOHISTOCHEMIE
.
81
4.1.19.1
DIE
RSLM-1
UND
RSLM-2-PROTEINEXPRESSION
IN
DER
HIPPOCAMPALEN
REGION
.
81
4.1.19.2.
DIE
RSLM-2-PROTEINEXPRESSION
IM
RATTEN-HODEN
.
84
4.1.20
WESTEM-BLOT-ANALYSEN
VON
RSLM-2
UND
RSLM-1
.
85
4.1.21
DIE
EINBINDUNG
VON
RSLM-2
IN
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGE
.
86
4.1.21.1
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
RSLM-2
.
87
4.1.21.2
RSLM-2
IST
EIN
SUBSTRAT
FUER
DIE
ABL-TYROSINKINASE
.
88
4.1.22
AUSWIRKUNGEN
DER
TYROSINPHOSPHORYLIERUNG
VON
RSLM-2
.
89
4.1.22.1
AUSWIRKUNG
DER
CO-EXPRESSION
VON
SRC
UND
ABI
AUF
DAS
ALTERNATIVE
SPLEISSEN
.
89
4.1.22.2
AUSWIRKUNG
DER
CO-EXPRESSION
VON
SRC
AUF
DIE
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
RSLM
2
UND
DEM
SPLEISSFAKTOR
HTRA2BETAL
.
90
4.2
NOP30:
EIN
NEUER
HUMANER
INTERAKTOR
DES
SPLEISSFAKTORS
SRP30C
.
92
4.2.1
DIE
DNA
SEQUENZ
VON
NOP30
.
92
4.2.2
DIE
PROTEINSEQUENZ
VON
NOP30
.
92
4.2.3
DIE
KLONIERUNG
VON
MYP,
DEM
HUMANEN
HOMOLOG
VON
U40627
.
94
4.2.4
DIE
ANALYSE
DES
NOP
GENS
.
95
4.2.4.1
DIE
KLONIERUNG
DES
NOP
GENS
.
95
4.2.4.2
DIE
SEQUENZIERUNG
DES
NOP
GENS
.
95
4.2.4.3
DIE
NOP30
UND
DIE
MYP-CDNA
WERDEN
DURCH
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
GENERIERT
.
96
4.2.4.4
AUSWIRKUNGEN
DES
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
DER
NOP
PRAE
MRNA
AUF
DER
PROTEINEBENE
.
99
4.2.4.5
DIE
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
DES
NOP
GENS
.
100
4.2.5
DIE
EXPRESSION
DER
VOP-MRNA-ISOFORMEN
.
102
4.2.5.1
NORTHERN
BLOT
ANALYSEN
.
102
4.2.5.2
VERHALTEN
DER
NOP30
RNA
WAEHREND
DER
MUSKELDIFFERENZIERUNG.
.
103
4.2.6
INTERAKTOREN
VON
NOP30
.
104
4.2.6.1
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEIN-PROTEIN
WECHSELWIRKUNGEN
IM
ZWEI-HYBRID-SYSTEM
DER
HEFE
.
104
4.2.OE.2
IN
VITRO
UNTERSUCHUNG
DER
NOP30-SRP30C
WECHSELWIRKUNG
.
106
4.2.6.3
BESTAETIGUNG
DER
BEOBACHTETEN
INTERAKTIONEN
MIT
HILFE
VON
IMMUNOPRAEZIPITATIONEN
.
107
4.2.OE.4
UBC9,
EIN
NEUER
INTERAKTOR
VON
NOP30
IM
ZWEI-HYBRID
SYSTEM
.
109
4.2.7
DIE
INTRAZELLULAERE
LOKALISATION
VON
NOP30
UND
SEINEN
INTERAKTOREN
.
110
4.2.7.1
DIE
LOKALISATION
VON
NOP30
.
110
4.2.7.2
DIE
LOKALISATION
DER
BINDUNGSPARTNER
VON
NOP30
.
111
4.2.7.3
VERGLEICH
DER
ZELLULAEREN
LOKALISATION
DER
ISOFORMEN
NOP30
UND
MYP
.
114
4.2.8
GEWINNUNG
VON
ANTI-NOP30
ANTISERUM
.
115
4.2.8.1
DIE
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
NOP30
PROTEIN
AUS
E.
COLI
BL21
.
115
4.2.8.2
DIE
UNTERSUCHUNG
DES
NOP30
ANTISERUMS
.
116
4.2.9
DIE
UNTERSUCHUNG
DER
FUNKTION
VON
NOP30
.
116
INHALTSVERZEICHNIS
5.
DISKUSSION
.
119
5.1
NEUE
INTERAKTOREN
VON
RSAF-B
UND
VON
SRP30C
.
119
5.1.1
NEUE
INTERAKTOREN
VON
RSAF-B
.
119
5.1.1.1
DIE
STAR-PROTEINE
BILDEN
HOMO
UND
HETEROMULTIMERE
.
120
5.1.1.2
DIE
STAR-PROTEINE
RSAM68,
RSLM-1
UND
RSLM-2 INTERAGIEREN
MIT
HNRNPS
.
121
5.1.2
DIE
INTERAKTION
MIT
SR-PROTEINEN
.
122
5.1.2.1
DER
SPLEISSFAKTOR
SRP30C
BINDET
AN
NOP30
UND
RSLM-2
.
122
5.1.2.2
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
BEEINFLUSST
DIE
BINDUNG
VON
NOP30
AN
DEN
SPLEISSFAKTOR
SRP30C
.
123
5.1.2.3
RSLM-2
BINDET
IN
VIVO
AN
SPLEISSFAKTOREN
.
123
5.2
DIE
INTRAZELLULARE
LOKALISATION
VON
NOP30
UND
RSLM-2
.
124
5.2.1
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
BEEINFLUSST
DIE
LOKALISATION
DER
AW-GEN-PRODUKTE.
124
5.2.1.1
NOP30
AKKUMULIERT
INNUKLEOLI
.
125
5.2.1.2
NOP30:
EIN
ZUSAMMENHANG
ZWISCHEN
MRNA-PROZESSIERUNG
UND
RRNA-PROZESSIERUNG?
.
126
5.2.1.3
MYP
IST
EIN
ZYTOPLASMATISCHES
PROTEIN
.
127
5.2.2
UBC9:
BEEINFLUSSUNG
DER
LOKALISATION
VON
NOP30
DURCH
SUMO-1?
.
128
5.2.3
DIE
KEMLOKALISATION
VON
RSLM-1
UND
RSLM-2
.
128
5.2.4
VERMAG
RSLM-2
ZWISCHEN
ZELLKERN
UND
ZYTOPLASMA
ZU
PENDELN?
.
129
5.3
DIE
NUKELEINSAEUREBINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
RSLM-1
UND
RSLM-2
.
130
5.4
RSLM-2
UND
NOP30:
IHRE
FUNKTION
BEIM
ZELLTYPSPEZIFISCHEN
ODER
GEWEBSSPEZIFISCHEN
ALTERNATIVEN
SPLEISSEN
.
132
5.4.1
DIE
SPEZIFITAET
DER
WIRKUNG
VON
RSLM-2
UND
NOP30
.
132
5.4.2
DER
EINBAU
VON
EXON
V5
DER
CD-M-PRAE-MRNA
.
133
5.4.3
DIE
AUTOREGULATION
VON
SPLEISSFAKTOREN
DURCH
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
.
134
5.4.4
PROBLEME
VON
IN
VIVO
SPLEISSVERSUCHEN
.
134
5.4.5
DIE
BEDEUTUNG
DER
EXPRESSION
VN
RSLM-2
IN
HIRN
UND
HODEN
.
135
5.4.6
DIE
BEDEUTUNG
DER
EXPRESSION
VON
NOP30
IM
MUSKELGEWEBE
.
136
5.5
SIGNALTRANSDUKTION
UND
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
.
136
5.6
SCHLUSSBEMERKUNG
.
139
6.
LITERATURVERZEICHNIS.
141 |
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