In vivo durch chemische Carcinogene initiierte Rattenleberzellen in vitro: Etablierung, cytogenetische und zellbiologische Charakterisierung immortalisierter und neoplastisch transformierter Zell-Linien
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1.
TUMORENTSTEHUNG
1
1
2.
DIE
LEBER,
ZENTRALES
STOFFWECHSELORGAN
UND
MODELLSYSTEM
DER
CANCEROGENESE
2
1
3.
SAEUGETIERZELLEN
IN
VITRO
4
1
4.
ZELLVERLUST
IN
NEOPLASTISCHEN
GEWEBEN
5
1.5
ZIEL
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
7
2
MATERIAL
UND
METHODEN
8
2
1
IN
VIVO-INITIATION,
ZELLGEWINNUNG
UND
SEPARATION/SELEKTION
8
2
1.1.
IN
VIVO-INITIATION
8
2.1.2.
ZELLGEWINNUNG
DURCH
IN
SITU-PERFUSION
9
2.1.3.
MECHANISCHE
ISOLIERUNG
FRUEHER
NEOPLASTISCHER
HERDE
11
2.2.
PRIMAERKULTUREN
UND
IN
VITRO-PROPAGIERUNG
(PRAE)NEOPLASTISCHER
LEBERZELLEN
11
2.2.1.
PRIMAERE
LEBERZELL-KULTUREN
12
2.2.2.
SUBKULTUREN
(PRAE)NEOPLASTISCHER
LEBERZELLEN
UND
PASSAGIEREN
12
2.2.3.
KRYOKONSERVIERUNG
DER
ZELLKULTUREN
13
2.2.4.
ADHAESIONS-,
SELEKTIONS
UND
WACHSTUMSFAKTOREN
13
2
3.
UNTERSUCHUNGEN
AN
IMMORTALISIERTEN
UND
NEOPLASTISCH
TRANSFORMIERTEN
LEBERZELL-LINIEN
14
2.3.1.
PHENOBARBITAL,
HSS,
SERUMERSATZSTOFFE,
HYDROXYHARNSTOFF
14
2.3.2.
SUSPENSIONS
UND
SOFTAGAR-WACHSTUM,
TUMORIGENITAET
IN
VIVO
15
2
3.3.
REKULTIVIERUNG
TUMORIGENER
ZELL-LINIEN
15
2.3.4.
ENZYM- UND
IMMUNHISTOCHEMIE
15
2
3.5.
BESTIMMUNG
ZELLKINETISCHER
PARAMETER
16
2
4
VERSUCHE
ZUR
ABKLAERUNG
DES
ZELLTYPS
NICHT
TUMORIGENER
ZELL-LINIEN
16
2.4.1.
CYTOKERATIN-NACHWEIS,
CK
7,
8,18,19
16
2.4.2.
BEHANDLUNG
MIT
PRONASE
UND
NATRIUM-BUTYRAT
17
2.4
3
TRANSFEKTIONS-UND
TRANSFORMATIONSANSAETZE
17
2
5.
PLOIDIE
UND
CHROMOSOMEN-ANALYSEN
18
2
5.1
DURCHFLUSS-CYTOMETRIE
18
2.5.2.
KARYOTYP-ANALYSEN
18
2.5.3.
SCE-ANALYSE
NACH
IN
VITRO-GABE
VON
DENA
UND
ENU
19
2.6
MIKROSKOPISCHE
UND
KINEMATOGRAFISCHE
BEOBACHTUNGEN
20
2
6.1
KINEMATOGRAFIE
UND
SERIELLE
MIKROFOTOGRAFIE
IM
PHASENKONTRAST
20
2
6
2.
FARB-MIKROFOTOGRAFIE
20
2.7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ONKOSE,
APOPTOSE
UND
NEKROSE
20
2.7.1
NACHWEIS
ONKOTISCHER
ZELLEN
MIT
TRYPANBLAU
21
2.7.2.
APOPTOSE-NACHWEIS
MIT
DER
TUNEL-METHODE
21
2
7.3.
APOPTOSE-NACHWEIS
MITTELS
DNA-IADDER
ASSAY
21
TABELLE
1
23-24
3.
ERGEBNISSE
25
3.1.
ISOLIERUNG,
KULTIVIERUNG
UND
ETABLIERUNG
VON
RATTENLEBERZELLEN
25
3.1.1.
PRIMAER
UND
SUBKULTUREN,
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
25
31.2.
SPEZIELLE
BEDINGUNGEN
IN
EINZELNEN
PRIMAER
UND
SUBKULTUREN
27
3
2.
IN
VIVO
DURCH
DENA
INDUZIERTE
ZELL-LINIEN
27
3.2.1.
DIE
TUMORIGENEN
HCC-LINIEN
CL 38
UND
CL
49
29
3.2.2.
DIE
IMMORTALISIERTE
LINIE
CL
44
MIT
BEGRENZTER
LEBENSDAUER
33
3.2.3.
DIE
TUMORIGENEN
HEPATOMHNIEN
CL
50
UND
CL
52
34
3.2.4.
DIE
TUMORIGENEN
HEPATOMLINIEN
FL
64
UND
FL
106 38
3.2.5.
IN
VIVO-KONTROLLTIERE
(DENA-STOP)
42
3.3.
IN
VIVO
DURCH
MNU
INDUZIERTE
ZELL-LINIEN
43
3.3.1.
DIE
IMMORTALISIERTEN
LINIEN
NT
27
UND
NT
96
43
3.3.2.
DIE
TUMORIGENE
HEPATOMLINIE
NT
92 46
TABELLE
2
48
3.4
ANDERE
RATTENTUMORE
IN
VITRO
49
3
4.1.
FAZA-HEPATOM
49
3.4.2.
SPONTANE
TUMORE
DER
WISTAR-RATTE
49
3.5.
VERAENDERUNG
DER
MODALEN
CHROMOSOMENZAHL/CYTOGENETISCHEN
PLOIDIE
51
TABELLE
3
52-54
3.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BEEINFLUSSUNG
VON
WACHSTUM
UND
DIFFERENZIERUNG
55
3.6.1.
BESTIMMUNG
DES
DNA-GEHALTS
(FLUSS-CYTOMETRIE)
55
3.6.2.
WIRKUNG
VON
PHENOBARBITAL,
HSS
UND
SERUMERSATZ
55
3.6.3.
HYDROXYHARNSTOFF
(HU)
SYNCHRONISATION
57
3.6.4.
VERHALTEN
GEGENUEBER
PRONASE
UND
NATRIUMBUTYRAT
58
3.6.5.
IMMUNHISTOCHEMISCHE
ERGEBNISSE
59
3.6.6.
TRANSFEKTION,
TRANSFORMATION
UND
SCE-ANALYSE
60
3.7.
MORPHOLOGISCHE
BEOBACHTUNGEN
62
3.7.1.
VERAENDERUNG
VON
ZELLFORM,
ZELLGROESSE
UND
ZELLVOLUMEN
62
3.7.2.
BESONDERHEITEN
IN
MITOSEN
63
3.7.3.
ABNORME
KARYO
UND
CYTOKINESE
BEI
CL
50,
MIKROKINEMATOGRAFIE
66
3.7.4.
ZELLUNTERGANG
IN
DER
MITOSE
BEI
LINIE
CL
49-VIII
69
3.8.
ZELLUNTERGANG
IN
VITRO:
ONKOSE,
NEKROSE,
APOPTOSE
71
3.8.1.
PRIMAERKULTUREN
71
3.8.2.
IN
SITU
CELL
DEATH
DETECTION
(TUNEL-METHODE)
72
3.8.3.
NACHWEIS
APOPTOSE-TYPISCHER
OLIGONUKLEOSOMEN
(DNA-IADDER
ASSAY)
74
4
DISKUSSION
75
4.1.
METHODISCHE
ASPEKTE
75
4.1.1.
SEPARATION
UND
SELEKTION
(PRAE)NEOPLASTISCHER
LEBERZELLEN
75
4
1
2
KULTURBEDINGUNGEN
75
4
1.3
WACHSTUMSFAKTOREN
(GROWTH
FACTORS,
GFS)
77
4
2.
WACHSTUMSVERHALTEN
UNTER
NORMALEN
UND
SPEZIELLEN
BEDINGUNGEN
79
4.2.1
PROGRESSION
DER
ZELL-LINIEN
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
79
4
2.2.
SPEZIFITAET
HEPATOZELLULAERER
UND
NEOPLASTISCHER
MARKER,
CYTOKERATINE
80
4.2.3
PHENOBARBITAL
(PB),
HYDROXYHARNSTOFF
(HU),
NA-BUTYRAT
(NB),
TRANSFEKTION
UND
TRANSFORMATION,
SCE-ANALYSE
82
4.3.
SPEZIFITAET
DER
CHROMOSOMEN-ABERRATIONEN
84
4.3.1
STRUKTURELLE
UND
NUMERISCHE
CHROMOSOMEN-ABERRATIONEN
84
4.3.2.
DENA
IM
VERGLEICH
ZU
MNU
85
4
2.3.
ZENTROMER
UND
TELOMER-REGIONEN
86
4.4.
VERAENDERUNG
DER
PLOIDIE
87
4.4.1
PLOIDIEWECHSEL
UND
MULTIPOLARE
MITOSEN
87
4.4.2.
HAPLOIDIE
UND
PCCS
89
4.5.
APOPTOSEN
90
5
ZUSAMMENFASSUNG
92
6.
ANHANG
94
7.
LITERATURVERZEICHNIS
109 |
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