Entenhepatitis-B-Virus (DHBV): ein Modellsystem für HBV zur Validierung von Inaktivierungs- und Desinfektionsverfahren
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1.
EINLEITUNG
.
7
1.1.
ENTENHEPATITIS
B-VIRUS
(DHBV)
.
G
1.2.
LITERATURUEBERSICHT
.
10
1.2.1.
EVOLUTION
DER
HEPADNAVIREN
.
10
1.2.2.
GENOMORGANISATION
.
10
1.2.3.
GENPRODUKTE
DES
DHBV
.
12
1.2.3.1.
VIRUSHUELLE
.
12
1.2.3.2.
NUKLEOKAPSID
.
13
1.2.3.3.
PRODUKTE
DES
P-ORF
.
15
1.2.4.
WEITERE
FUNKTIONEN
.
15
1.2.5.
VIRUSREPLIKATION
.
15
1.2.5.1.
GENOMREPLIKATION
.
17
1.2.5.2.
REGULATORELEMENTE.
18
1.2.6.
EPIDEMIOLOGIE
DES
ENTENHEPATITIS
B-VIRUS
(DHBV)
.
19
1.2.7.
VIRUSUEBERTRAGUNG
.
20
1.2.7.1.
NATUERLICHE
DHBV-INFEKTION
.
20
1.2.7.2.
EXPERIMENTELLE
DHBV-INFEKTION
.
21
1.2.8.
IMMUNOLOGIE
.
22
1.2.9.
EXTRAHEPATISCHE
VIRUSREPLIKATION
.
23
1.2.10.
KRANKHEITSBILDER
BEI
ENTEN
UND
ANDEREN
EMPFAENGLICHEN
SPEZIES.
23
1.2.11.
WEITERE
LEBERERKRANKUNGEN
BEI
ENTE
UND
GANS
.
25
1.2.12.
DIAGNOSTIK
.
25
1.2.13.
THERAPIE
UND
PROPHYLAXE
.
26
1.2.14.
HEPADNAVIREN
BEI
MENSCH
UND
ANDEREN
SAEUGERN
.
27
1.2.14.1.
HUMANES
HEPATITIS
B-VIRUS
(HBV)
.
27
1.2.14.2.
WOODCHUCK
HEPATITIS
B-VIRUS
(WHV)
.
29
1.2.14.3.
GROUND
SQUIRREL
HEPATITIS
B-VIRUS
(GSHV)
.
29
1.2.15.
HERON
HEPATITIS
B-VIRUS
(HHBV)
.
30
2.
PROBLEMSTELLUNG
.
31
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
33
3.1.
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE.
33
3.1.1.
KRYOKONSERVIERUNG
VON
BAKTERIEN
(DH5A)
.
34
3.1.2.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
34
3.1.3.
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
.
34
3.1.4.
AUSSCHNEIDEN
DER
DHBV-DNA
AUS
DEM
PLASMID
.
34
3.1.5.
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IM
AGAROSEGEL
.
35
3.1.6.
EXTRAKTION
VON
PLASMID-DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
36
3.2.
ZELLKULTUR
.YY
.
36
3.2.1.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLLINIEN
.
36
3.3.
TIERVERSUCHE
.
37
3.3.1.
BRUTBEDINGUNGEN
.
37
3.3.2.
IN
OVO-LNFEKTION
VON
PEKINGENTEN
MIT
DHBV
.
37
3.3.3.
TIERHALTUNG
.
37
3.3.4.
GEWINNUNG
VON
SEREN
/
DHBV-VORRAETEN
.
38
3.3.5.
ENTNAHME
VON
BLUTPROBEN
.
38
3.3.6.
TOETUNG
DER
TIERE
.
38
3.3.7.
DHBV-VORRAETE
.
38
3.4.
PRIMAERE
EMBRYONALE
ENTENHEPATOZYTENKULTUREN
.
39
3.4.1.
ANLEGEN
VON
HEPATOZYTENKULTUREN
.
39
3.4.1.1.
OPTIMIERUNG
BEIM
ANLEGEN
DER KULTUREN
.
40
3.4.1.2.
OPTIMIERUNG
BEI
DER
KULTIVIERUNG
.
41
3.5.
CHARAKTERISIERUNG
VON
ZELLKULTUREN
.
42
3.5.1.
CHARAKTERISIERUNG
VON
HEPATOZYTENKULTUREN
IM
WST-TEST
.
42
3.5.2.
LICHTMIKROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
ZELLKULTUREN
.
42
3.5.2.1.
HE-FAERBUNG
.
42
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.2.2.
PAS-REAKTION
.43
3.5.2.3.
FETTFAERBUNG
.43
3.5.3.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
ZELLKULTUREN
.43
3.6.
WEITERE
PRIMAERE
EMBRYONALE
ENTENZELLKULTUREN
.43
3.6.1.
GEWEBEKULTUREN
.
44
3.6.1.1.
MESENCHYMALE
ZELLEN
.44
3.6.1.2.
EPITHELIALE
ZELLEN
.
45
3.6.1.3.
NEUROEKTODERMALE
ZELLEN
.46
3.6.1.4.
HAEMATOPOETISCHE
UND
LYMPHATISCHE
ZELLEN
.46
3.6.1.5.
DUENNDARM
UND
DRUESENMAGEN
.47
3.6.1.6.
ZELLKULTUREN
AUS
EIHAEUTEN
.47
3.7.
ZELLZAEHLUNG
.
47
3.8.
INFEKTION
VON
ZELLKULTUREN
.48
3.8.1.
INFEKTION
MIT
DHBV
.48
3.8.2.
INFEKTION
MIT
WEITEREN
VIREN
.
49
3.9.
ZELLERNTE
.49
3.9.1.
ERNTE
VON
PRIMAEREN
EMBRYONALEN
ENTENHEPATOZYTEN
.
49
3.10.
CHARAKTERISIERUNG
INFIZIERTER
PRIMAERER EMBRYONALER
ENTENHEPATOZYTENKULTUREN
MITTELS
INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ
.
50
3.11.
KRYOPRAESERVATION
VON
PRIMAEREN
EMBRYONALEN
ENTENHEPATOZYTEN
.
50
3.12.
DNA-EXTRAKTION
.
51
3.12.1.
DNA-EXTRAKTION
AUS
KULTURZELLEN
.
51
3.12.2.
DNA-EXTRAKTION
AUS
ORGANEN
.
52
3.12.3.
DNA-EXTRAKTION
AUS
SERUM
.
52
3.13.
NACHWEIS
VIRALER
DNA
.
53
3.13.1.
SOUTHERN
BLOT
.
53
3.13.2.
DOT
BLOT
.
54
3.13.2.1.
ALKALISCHE
DENATURIERUNG
(STANDARDMETHODE)
.
54
3.13.2.2.
HITZEDENATURIERUNG
UNTER
ALKALISCHEN
BEDINGUNGEN
.
54
3.13.2.3.
HITZEDENATURIERUNG
MIT
NEUTRALISIERUNG
.
54
3.13.2.4.
PROTEINVERDAU
.
55
3.13.3.
NACHWEIS
VON
DHBV-DNA
MIT
PEROXYDASE-MARKIERTER
SONDE
.
55
3.13.3.1.
MARKIERUNG
DER
SONDEN
.
56
3.13.3.2.
HYBRIDISIERUNG
.
56
3.13.3.3
WASCHEN
.
56
3.13.3.4.
DETEKTION
.
56
3.13.4.
NACHWEIS
VON
DHBV-DNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SONDE
.
57
3.13.4.1.
MARKIERUNG
DER
SONDE
.
57
3.13.4.2.
HYBRIDISIERUNG
.
57
3.13.4.3
WASCHEN
UND
DETEKTION
.
58
3.14.
KONZENTRIERUNG
VON
DHBV
.
58
3.14.1.
POLYAETHYLENGLYKOL
(PEG)
.
58
3.14.2.
ULTRAZENTRIFUGATION
UND
PELLETIERUNG
DURCH
SACCHAROSEKISSEN
.
58
3.15.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
58
3.15.1.
UNG-BEHANDLUNG
.
59
3.15.2.
ENTEN-BETAGLOBIN-PCR
.
59
3.15.3.
VERWENDETE
PRIMER
.
59
3.15.4.
SPEZIFITAET
UND
SENSITIVITAET
.
60
3.15.5.
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
.60
3.15.5.1.
DIREKTEINSATZ
VON
ENTENSERUM
IN
DIE
PCR
NACH
ALKALISCHER
LYSE
.
61
3.15.6.
PRODUKTANALYSE
.
61
3.16.
UNTERSUCHUNGEN
ZU
VIRUSINAKTIVIERUNG,
STABILITAET,
DESINFEKTIONSMITTELWIRKSAMKEIT
.
61
3.16.1.
MODELLVIREN
ALS
SYSTEM
UND
REAGENZIENKONTROLLE
.
61
3.16.1.1.
SCHWEINEHERPESVIRUS
TYP
1
(SHV-1)
.
61
3.16.1.2.
VESIKULAERES
STOMATITIS
VIRUS
(VSV)
.
62
3.16.2.
VALIDIERUNG
VON
VIRUSINAKTIVIERUNGSVERFAHREN
.
62
3.16.2.1.
PASTEURISIERUNG
.63
3.16.2.2.
BETA-PROPIOLACTON
.63
2
INHALTSVERZEICHNIS
3.16.2.3.
SOLVENT
/
DETERGENS
SD-VERFAHREN
.
64
3.16.3.
VIRUSTITRATIONEN
.
64
3.16.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STABILITAET
VON
DHBV
.
66
3.16.4.1.
LAGERUNG
BEI
RAUMTEMPERATUR
.
66
3.16.4.2.
TROCKNUNG
.
66
3.16.5.
UEBERPRUEFUNG
VON
DESINFEKTIONSMITTELWIRKSAMKEIT
GEGEN
DHBV
.
67
3.16.5.1.
ALKOHOLE
.
67
3.16.5.2.
FORMALDEHYD
.
67
3.16.5.3.
LYSOFORMIN
SPEZIAL
.
68
4.
ERGEBNISSE
.
69
4.1.
OPTIMIERUNG
DES
AUSGANGSMATERIALS
UND
DER
KULTURBEDINGUNGEN
VON
PRIMAEREN
EMBRYONALEN
ENTENHEPATOZYTEN
.
69
4.1.1.
DHBV-STATUS
DER
EMBRYONEN
.
69
4.1.2.
ALTER
DER
EMBRYONEN
.
70
4.1.3.
ANLEGEN
DER
HEPATOZYTENKULTUREN
.
71
4.1.4.
OPTIMIERUNG
DER
KULTURBEDINGUNGEN
.
72
4.1.4.1.
ABHAENGIGKEIT
DES
ZELLWACHSTUMS
VON
KULTURMEDIEN
UND
ZELLDICHTE
.
72
4.1.4.2.
PASSAGIERBARKEIT
.
72
4.1.4.3.
GEWEBE
BZW.
EXPLANTATKULTUR
.
73
4.1.4.4.
EINFLUSS
DER
BESCHICHTUNG
VON
KULTURGEFAESSEN
.
73
4.2.
CHARAKTERISIERUNG
VON
HEPATOZYTENKULTUREN
UND
LANGZEITKULTIVIERBARKEIT
.
74
4.2.1.
LICHTMIKROSKOPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
HEPATOZYTENKULTUREN
.
74
4.2.2.
ENTWICKLUNG
DER
ZELLZAHLEN
IM
KULTURVERLAUF
.
77
4.2.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
ZELLZAHLEN
UND
VIABILITAET
DER
HEPATOZYTENKULTUREN
IM
WST-TEST
.
77
4.2.4.
EINFLUESSE
VERSCHIEDENER
MEDIENZUSAETZE
AUF
DIE
VIABILITAET
VON
HEPATOZYTENKULTUREN
.
78
4.3.
KRYOKONSERVIERUNG
VON
PRIMAEREN
EMBRYONALEN
ENTENHEPATOZYTEN
.
81
4.4.
VERSUCHE
ZUR
INFIZIERBARKEIT
PERMANENTER
ZELLLINIEN
UND
WEITERER
EMBRYONALER
ENTENZELLEN
MIT
DHBV
.
83
4.4.1.
PERMANENTE
ZELLLINIEN
.
83
4.4.2.
PRIMAERKULTUREN
EMBRYONALER
ENTENZELLEN
.
83
4.5.
OPTIMIERUNG
DES
NACHWEISES
DER
DHBV
IN
VITRO-INFEKTION
.
89
4.5.1.
REPRODUZIERBARKEIT
DER
DHBV-INFEKTION
.
90
4.5.2.
DHBV-NACHWEIS
IM
KULTURVERLAUF
.
90
4.5.3.
NACHWEIS
VON
DHBV
IN
ZELLKULTURUEBERSTAENDEN
.
92
4.6.
DHBV-NACHWEIS
IN
ENTENSERUM
.
93
4.6.1.
NACHWEIS
VIRALER
DNA
IM
DOT BLOT
UEBER
PEROXYDASE-MARKIERTE
SONDE
.
93
4.6.2.
NACHWEIS
VIRALER
DNA
IM
DOT
BLOT
UEBER
RADIOAKTIV
MARKIERTE
SONDE
.
94
4.7.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
95
4.7.1.
SPEZIFITAET
UND
SENSITIVITAET
DES
DHBV-NACHWEISES
.
95
4.7.2.
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
AUFSCHLUSSVERFAHREN
VON
ENTENSERUM
.
96
4.7.3.
ERHOEHUNG
DER
SENSITIVITAET
.
98
4.7.3.1
.
HYBRIDISIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
MIT
DHBV-SPEZIFISCHER
SONDE
.
98
4.7.3.2.
"NESTED
PCR
"
.
99
4.7.4.
ENTEN-BETAGLOBIN-PCR
.
100
4.7.5.
HEMMUNG
VON
DHBV
UND
BETAGLOBIN-PCR DURCH
ENTENSERUM
.
101
4.8.
DHBV-PRAEVALENZEN
IN
KOMMERZIELLER
PEKINGENTENHALTUNG
.
101
4.9.
ETABLIERUNG
EINER
SPEZIFISCH
DHBV-FREIEN
LEGEHERDE
.
103
4.9.1.
ERWEITERUNG
DES
SPEZIFISCH
DHBV-FREIEN
PEKINGENTENBESTANDES
.
104
4.9.2.
MONITORING
DER
DHBV-FREIHEIT
DER
NACHKOMMENSCHAFT
.
105
4.10.
IN
OVO-LNFEKTION
MIT
DHBV
.
105
4.11.
DHBV-VIRUSVORRAETE
.
108
4.12.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STABILITAET
DES
DHBV
.
108
4.12.1.
LAGERUNG
VON
DHBV-POSITIVEN
SEREN
BEI
RAUMTEMPERATUR
.
108
4.12.2.
TROCKNUNG
BEI
RAUMTEMPERATUR
(21
-
22
C)
.
109
4.12.2.1.
TROCKNUNG
AUF
STERILEN
FILTERPAPIERPLAETTCHEN
.
109
4.12.2.2.
TROCKNUNG
AUF
GLATTEN
OBERFLAECHEN
.
110
4.13.
UEBERPRUEFUNG
VON
DESINFEKTIONSMITTELWIRKSAMKEIT.
110
4.13.1.
ALKOHOLE
.
110
3
INHALTSVERZEICHNIS
4.13.1.1.
INAKTIVIERUNG
VON
DHBV
AUF
FILTERPAPIER
MIT
70
%
ISOPROPYLALKOHOL.
111
4.13.2.
FORMALDEHYD.
112
4.13.3.
LYSOFORMIN
SPEZIAL
.
113
4.14.
VALIDIERUNG
VON
VIRUSINAKTIVIERUNGSVERFAHREN
.
114
4.14.1.
ANREICHERUNG
VON
ENTENSEREN
MIT
DEN
MODELLVIREN
SHV-1
UND
VSV
.
114
4.14.2.
PASTEURISIERUNG
.
114
4.14.3.
KALTSTERILISATION
MIT
BETA-PROPIOLACTON
(BPL)
.
118
4.14.3.1.
KORRELATION
VON
GENOMNACHWEIS
IN
DER
PCR
UND
VON
INFEKTIOSITAET
.
120
4.14.4.
SOLVENT
/
DETERGENS-VERFAHREN
.
121
5.
DISKUSSION
.
125
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
143
6.
SUMMARY
.
145
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
147
8.
ANHANG
.
167
9.
DANKSAGUNG
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LEBENSLAUF
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