Charakterisierung und Isolation von Melanom-assoziierten Transkriptionsfaktoren durch Analyse des MIA-Promoters:
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2000
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| adam_text | CHARAKTERISIERUNG UND ISOLATION VON MELANOM-ASSOZIIERTEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN DURCH ANALYSE DES MIA-PROMOTERS DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER
NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET IV - CHEMIE UND PHARMAZIE - DER
UNIVERSITAET REGENSBURG VORGELEGT VON MICHAELA GOLOB AUS ROSENHEIM 2000
INHALTSVERZEICHNIS I. ZUSAMMENFASSUNG 1 N. ABKUERZUNGEN 3 HI. EINLEITUNG
5 1. DAS MALIGNE MELANOM (MM) 5 1.1 PROLIFERATION 9 1.2
TUMORSUPPRESSORGENE UND ONKOGENE 10 1.3 INVASION UND ADHAESIONSMOLEKUELE
12 1.4 TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 13 2. MIA (MELANOMA INHIBITORY ACTIVITY)
15 3. PROBLEMSTELLUNG 18 IV. MATERIAL UND METHODEN 19 1. PUFFER, MEDIEN
UND LOESUNGEN 19 2. MATERIALIEN 25 2.1 PLASMIDE 25 2.2 CHEMIKALIEN UND
ENZYME 25 2.3 GERAETE 27 2.4 PRIMER 28 2.5 ANTIKOERPER 30 2.6 BAKTERIEN
UND ZELLINIEN 31 3. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 3.1 KULTIVIERUNG VON
BAKTERIEN 3.2 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN _32 32 3.2.1
POLYMERASE-CHAIN-REACTION (PCR) 3.2.2 *SELBST-GEPRIMTE PCR
PROTEIN-BINDENDER OLIGONUKLEOTIDE 3.2.3 REINIGUNG DER DNA-FRAGMENTE _32
32 3.2.4 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN_ 3.2.5 LIGATION VON
DNA-FRAGMENTEN 3.2.6 MUTAGENESE 3.2.7 TRANSFORMATION _33 . 33 , 34 _34
.34 35 3.2.7.1 HERSTELLUNG VON TRANSFORMATIONSKOMPETENTEN BAKTERIEN_
3.2.7.2 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA 3.2.8 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA
AUS E.COLI J5 36 36 3.2.8.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM KLEINEN
MASSSTAB SSFINIPRAEPARATION) 37 3.2.8.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM
GROSSEN MASSSTAB (MAXIPRAEPARATION) 37 3.2.8.3 DNA/RNA
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 35 3.2.9 PLASMIDPRAEPARATION NACH HIRT 3.3
SEQUENZIERUNG 3.4 RNA-ISOLIERUNG UND GELELEKTROPHORESE 3.4.1
RNA-ISOLIERUNG 3.4.2 RNA-GELE 38 _39 39 3.5 REVERSE TRANSCRIPTASE
(RT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 3.6 GELELEKTROPHORESE 3.6.1
AGAROSE-GELE 3.6.2 PAA-GELE .39 _40 _40 41 42 3.6.2.1
SDS-PAGE-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) [LAEMMLI ET AL 19701 42 3.6.2.2
EMSA-GEL E ~ ** 43 3.7 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON SONDEN 3.7.1 SONDEN
FUER ELECTROPHORETIC-MOBILITY-SHIFT ASSAYS. 3.7.2 SONDEN FUER
*SOUTH-WESTERN-BLOTS 3.7.3 REINIGUNG RADIOAKTIV MARKIERTER
DNA-FRAGMENTE _ 4. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 4.1 PRAEPARATION VON
KEMEXTRAKTEN 4.2 *IN VITRO -TRANSLATION 4.3 BESTIMMUNG DES
PROTEINGEHALTS_ 4.4 WESTERN-BLOT 4.5 SOUTH-WESTERNBLOT_ 4.6
GEL-SHIFT-ASSAY 4.7 ISOLIERUNG DNA-BINDENDER PROTEINE _____ 4.8
KONZENTRIEREN UND REINIGEN VON PROTEINEN^ 4.9 SILBERFAERBUNG VON
SDS-PAGE-GELEN 5. ZELLKULTUR UND TRANSFEKTIONEN 5.1 KULTIVIERUNG VON
EUKARYONTISCHEN ZELLEN 5.2 TRANSIENTE TRANSFEKTIONEN 5.3
LUCIFERASE-ASSAY 5.4 MIA-ELISA 5.5 IN VIVO -EXPRESSIONSKLONIERUNG V.
ERGEBNISSE 1. LOKALISIERUNG TRANSKRIPTIONSREGULIERENDER
PROMOTERSEQUENZEN 1.1 SEQUENZANALYSE DES MURINEN MIA-PROMOTERS 1.2
EINENGUNG DER MELANOMSPEZIFISCHEN AKTIVITAET DES MIA-PROMOTERS 2. SUCHE
NACH ZELLSPEZIFISCHEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 43 _43 44 44 45 45 45 46 46
47 47 48 50 50 51 _52 _53 _54 55 _55 _55 _58 61 3. HOMOLOGIEVERGLEICH
DER MURINEN UND HUMANEN OLIGO C-SEQUENZ 63 4. ANALYSE DER REGION Y 64
4.1 SEQUENZANALYSE VON Y 64 4.2 EINFLUSS DER HMG-BOX PROTEINE LEF/TCF 68
4.3 IN VIVO-EXPRESSIONSSCREENING NACH MIA REGULIERENDEN GENEN 73 4.4
EINFLUSS VON E-CADHERIN AUF DIE AKTIVITAET DES MIA-PROMOTERS 74 5. ANALYSE
DER REGION X 78 5.1 SEQUENZANALYSE DER REGION X 78 5.2 NACHWEIS EINER
SPEZIFISCHEN PROTEINBINDUNG AUF X 79 5.3 ANALYSE DER PROTEINBINDUNG AUF
REGION X 81 5.4 ISOLIERUNG DES AKTIVIERENDEN TRANSKRIPTIONSFAKTORS 82
5.5 IDENTIFIZIERUNG DES ISOLIERTEN PROTEINS ALS HMG-1 85 VL DISKUSSION
86 1. ERMITTLUNG WICHTIGER MLA-PROMOTERREGIONEN 86 2. HOMOLOGIEVERGLEICH
DER MURINEN UND HUMANEN OLIGO C SEQUENZ 90 3. CHARAKTERISIERUNG DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLE Y 90 4. CHARAKTERISIERUNG DER REGION
X 96 5. MODELL DER TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG DES MIA-PROMOTERS 99 6.
AUSBLICK 101 VII. LITERATUR 102
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