Regulation der AP-2alpha-Expression durch Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren:
Gespeichert in:
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| Veröffentlicht: |
2000
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ABKUERZUNGEN
INHALTSVERZEICHNIS
LISTE
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
INHALTSVERZEICHNIS
L
EINLEITUNG
1,
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
1
1.1,
NOTWENDIGKEIT
DER
GENREGULATION
1.2.
MOEGLICHKEITEN
DER
GENREGULATION
1.3.
BASALE
TRANSKRIPTION
1.4.
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
1.5.
REGULATION
VON
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
1.6.
TUMORENTSTEHUNG
UND
TRANSKRIPTIONSREGULATION
1
1
2
4
5
6
2.
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
AP-2
7
2.1.
KLONIERUNG
UND
STRUKTUR
VON
AP-2
7
2.2.
SPLEISSVARIANTEN
UND
ISOFORMEN
VON
AP-2
8
2.3.
REGULATION
VON
AP-2
9
2.4.
INTERAKTION
VON
AP-2
MIT
ANDEREN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
10
3.
ONKOGENES
POTENTIAL
VON
ADENOVIREN
11
3.1.
KLASSIFIZIERUNG
DER
ADENOVIREN
11
3.2.
ADENOVIRUS-VERMITTELTE
TRANSFORMATION
12
3.3.
DIE
PROTEINE
DER
EL-REGION
12
4.
ZIELSETZUNG
13
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
1.
MATERIAL
14
1.1.
MATERIAL
ALLGEMEIN
14
1.2.
GERAETE
16
1.3.
VERWENDETE
ORGANISMEN
18
1.4.
VERWENDETE
VEKTOREN
19
1.5.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
21
1.6.
MEDIEN,
ANTIBIOTIKA
UND
PUFFER
24
1.6.1.
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
E
COLI-,
HEFE
UND
SAEUGERZELLKULTUREN
24
1.6.2.
ANTIBIOTIKA
UND
SELEKTIONSSTAMMLOESUNGEN
24
1.6.3.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
25
AKUERZUNGEN
2.
METHODEN
30
2.1.
ARBEITEN
MIT
ESCHERICHIA
COLI
30
2.1.1.
KULTIVIERUNG
VON
E.
COLI
30
2.1.2.
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.
CO/I-ZELLEN
31
2.1.3.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
31
2.1.4.
SELEKTION
MITTELS
LACZ-A-KOMPLEMENTATION
31
2.1.5.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
('MINIPRAEPARATION')
32
2.1.6
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
GROSSEN
MASSSTAB
('MAXIPRAEPARATION')
32
2.1.7.
COLONY
SCREENING
33
2.2
ARBEITEN
MIT
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
34
2.2.1.
KULTIVIERUNG
VON
S.CEREVISIAE
34
2.2.2.
TRANSFORMATION
VON
S.CEREVISIAE
34
2.2.3.
PLASMIDISOLATION
UND
ISOLATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
S.CEREVISIAE
34
2.2.4.
S.CEREVISIAE
TWO-HYBRID-SCREENING
35
2.2.5.
SS-GALAKTOSIDASE-FILTERTEST
35
2.3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
36
2.3.1.
DNA-TECHNIKEN
-
36
2
3.1.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
36
2.3.1.2.
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
36
2.3.1.3.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
36
2.3.1.4.
DNA-UND
RNA-KONZENTRATRIONSBESTIMMUNG
37
2.3.1.5.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
GESPALTENER
VEKTOR-DNA
37
2.3.1.6.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
37
2.3.1.7.
KONKATEMERISIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
38
2.3.1.8.
TRANSFER
VON
DNA
AUFNYLOIUNEMBRANEN
('SOUTHERN
BLOT')
38
2.3.1.9.
HYBRIDISIEREN
VON
BLOTS
38
2.3.1.10.
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
39
2.3.1.11.
POLYACRYLAMID-HAMSTOFF-GELELEKTROPHORESE
39
2.3.1.12.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
40
2.3.1.13.
REINIGUNG
RADIOAKTIVMARKIERTER
DNA-FRAGMENTE
40
2.3.1.14.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
41
2.3.1.15.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
41
2.3.1.16.
RT-PCR
42
2.3.1.17.
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
42
2.3.2.
RNA-TECHNIKEN
43
2.3.2.1
.
RNA-ISOLATION
AUS
ZELLEN
UND
GEWEBEN
DURCH
SAURE
EXTRAKTION
MIT
GUANIDINIUMTHIOCYANAT
PHENOL-CHLOROFORM
43
2.3.2.2.
ISOLIERUNG
VON
RNA
DURCH
CAESIUMCHLORIDGRADIENTEN-ZENTRIFTIGATION
43
2.3.2.3.
GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
44
2.3.2.4.
TRANSFER
VON
RNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
('NORTHERN
BLOT')
44
2.3.2.5.
ANREICHERUNG
VON
POLY-(A
+
)-RNA
44
2.3.2.6.
QUANTITATIVE
PCR
('TAQMAN-PCR')
45
2.4.
ARBEITEN
MIT
X-PHAGEN
46
2.4.1.
DNA-SCREENING
VON
PHAGEN-BANKEN
46
2.4.2.
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
46
2.5.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
47
2.5.1.
PROTEINBESTIMMUNG
47
2.5.2.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
47
2.5.3.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE-MEMBRANEN
('WESTERN
BLOT')
47
2.5.4.
PROTEINDETEKTION
AUF
WESTERN
BLOTS
48
2.5.5.
HERSTELLUNG
VON
GESAMTPROTEINEXTRAKTEN
48
2.5.6.
IN
VITRO
TRANSLATION
48
2.5.7.
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
(GST)
FUSIONSPROTEINEN
49
2.5.8.
PRAEPARATION
VON
CYTOPLASMA-UND
KEMEXTRAKTEN
49
2.5.9.
GST-FUSIONSPROTEIN-INTERAKTIONSASSAY
(GST-PULL
DOWN')
50
2.5.10.
IMMUNPRAEZIPITATION
50
2.5.11.
GELSHIFT
ASSAY
('EMS
A')
50
2.5.12.
ISOLIERUNG
SPEZIFISCH
PROTEININTERAGIERENDER
DNA-STELLEN:
51
'BINDING
SITE
SELECTION
ASSAY'
2.6.
ZELLKULTURMETHODEN
52
ABKUERZUNGEN
2.6.1.
KULTIVIERUNG
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
52
2.6.2.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
ZELLKULTURZELLEN
52
2.6.2.1.
KALZIUM-PHOSPHAT-PRAEZIPITATION
LIPOFECTAMIN
-TRANSFEKTION
52
2.6.2.2.
52
2.6.3.
LUCIFERASE
REPORTERGEN
ASSAY
52
2.6.4.
ZELLKULTIVIERUNG
FUER
IMMUNHISTOCHEMIE
53
2.6.5.
GFP-NACHWEIS
53
2.6
6.
ZELLFIXIERUNG
53
2.6.7
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
54
2.7.
EMBRYONALE
STAMMZELLTECHNIKEN
54
2.7.1.
KULTIVIERUNG
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
54
2.7.2.
KULTIVIERUNG
VON
EMBRYONALEN
FEEDERZELLEN
55
2.7.3.
ELEKTROPORATION
DER
ES-ZELLEN
MIT
'KNOCK
OUT'
VEKTOREN
55
2.7.4.
SELEKTION
VON
NEOMYCINRESISTENTEN
ES-ZELLKLONEN
56
2
7.5.
DNA-ISOHERUNG
AUS
ES-ZELLEN
UND
RE
STRIKTIONSVERDAU
56
2.7.6.
INJEKTION
UND
TRANSFER
VON
ES-ZELLEN
IN
TAG
3
MAUSBLASTOZYSTEN
56
2.8.
ADENOVIRALE
INFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
57
2.8.1.
INFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
MIT
ADENOVIREN
57
2.8.2.
ADENOVIRUS-STAMMLOESUNGEN
57
IN.
ERGEBNISSE
1.
VORARBEITEN
AUS
DER
DIPLOMARBEIT
58
1.1.
KLONIERUNG
DER
AP-2REP
UND
BTEB-1
CDNAS
58
12.
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
60
1.2.1.
DNA-BINDUNGSSPEZIFITAET
VON
AP-2REP
AM
A32-ELEMENT
60
1.2.2.
TRANSKRIPTIONSREGULATORISCHE
AKTIVITAET
VON
AP-2REP
UND
BTEB-1
60
1.3.
GEWEBSSPEZIFISCHE
EXPRESSION
61
2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
TRANSKRIPTIONELLEN
REGULATION
VON
AP
2
DURCH
AP-2REP
UND
BTEB-1
62
2.1.
EXPRESSION
DER
AP-2REP
MRNA
62
2.2.
DNA-BINDUNG
VON
BTEB-1
UND
AP-2REP
65
2.2.1.
DNA-BINDUNG
VON
BTEB-1
65
2.2.2.
DNA-BINDUNG
VON
AP-2REP
67
2.2.2.1.
WECHSELWIRKUNGEN
MIT
DEM
A32
ELEMENT
67
2.2.2.2.
'BINDING
SITE
SELECTION
ASSAY'
68
2
2.2.3.
AKTIVITAET
DER
BINDESTELLEN
IM
LUCIFERASE
REPORTERGENASSAY
70
2.3.
TRANSKRIPTIONELLE
REGULATION
DES
AP-2*
-PROMOTORS
DURCH
AP-2*
,
BTEB-1
UND
AP-2REP
71
3.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
AP-2REP
73
3.1.
AP-2REP-DOMAENEN
73
3.2.
INTERAKTION
VON
AP-2REP
MIT
ANDEREN
PROTEINEN
76
3.2.1.
KLONIERUNG
DES
MURINEN
CTBP-1
76
3.2.2.
INTERAKTION
VON
AP-2REP
UND
CTBPL
78
4.
REGULATION
DER
AP-2Q-EXPRESSION
DURCH
EIA
81
4.1.
ERHOEHUNG
DES
AP-2-PROTEINSPIEGELS
NACH
ADENOVIRALER
INFEKTION
VON
ZELLEN
81
4.2.
TRANSKRIPTIONELLE
REGULATION
VON
AP-2*
DURCH
EIA
83
4.2.1.
PROMOTORSTUDIEN
83
AKUERZUNGEN
4.2.2.
AP-2-PROTEINMENGEN
85
5.
GEZIELTE
GENZERSTOERUNG
DES
AP-2REP-GENES
86
5.1.
ISOLIERUNG
DES
GENOMISCHEN
LOKUS
87
5.2.
KLONIERUNG
DES
YYTARGETING
"
VEKTORS
88
5.3.
GENERIERUNG
HETEROZYGOT
AP-2REP-DEFIZIENTER
STAMMZELLKLONE
89
5.4.
STAMMZELLTRANSFER
UND
ANALYSE
VON
MAUS-DNA
90
5.5.
ANALYSE
DER
AP-2REP
'KNOCKOUT'
MAUS
91
IV.
DISKUSSION
1.
DIE
PROMOTORREGION
VON
AP-2Q
93
2.
BTEB-1
ALS
REGULATOR
DER
AP-2Q-EXPRESSION
93
3.
AP-2REP
ALS
REGULATOR
DER
AP-2Q-EXPRESSION
95
4.
EIA
ALS
REGULATOR
DER
AP-2Q-EXPRESSION
99
V.
ZUSAMMENFASSUNG
101
VI.
LITERATUR
103 |
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