Untersuchungen zu Regulation und Funktion des Transkriptionsfaktors AP-2:
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| Format: | Buch |
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1999
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| Beschreibung: | Regensburg, Univ., Diss., 1999 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
EINLEITUNG_ L
1 DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR AP-2.1
1.1 KLONIERUNG UND STRUKTUR VON AP-2.1
1.2 GENOMISCHE STRUKTUR UND ISOFORMEN VON AP-2.1
1.3 REGULATION VON AP-2.2
2 DIFFERENZIERUNG.4
2.1 MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER DIFFERENZIERUNG.4
2.2 AP-2 UND DIFFERENZIERUNG.5
3 DER ZELLZYKLUS.5
3.1 DIE ZELLZYKLUSMASCHINERIE.5
3.2 GL UND GL/S-UEBERGANG.7
3.3 REGULATION DER CDKS.7
3.4 AP-2 IN PROLIFERATION UND ZELLZYKLUSKONTROLLE.8
4 APOPTOSE UND PROGRAMMIERTER ZELLTOD.10
4.1 DIE YYEXEKUTIONSMASCHINERIE".11
4.2 C-MYC-REGULIERTE APOPTOSE.13
4.3 AP-2 UND C-MYC-INDUZIERTE APOPTOSE.15
5 AP-2 UND AP-2REP.16
6 ZIELSETZUNG. 16
II
MATERIAL_17
1 CHEMIKALIEN UND REAGENTIEN.17
2 STANDARDS UND KITS.18
3 ENZYME UND ANTIKOERPER.18
4 SONSTIGES MATERIAL.19
5 GERAETE.19
6 VERWENDETE ORGANISMEN.
20
7 VERWENDETE VEKTOREN.
22
8 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE.
23
9 VERWENDETE MEDIEN, PUFFER, LOESUNGEN.
26
9.2 MEDIEN ZUR ANZUCHT VON E.COLI UND SAEUGERZELLKULTUREN.26
9.2 PUFFER UND LOESUNGEN.26
III
METHODEN_31
1 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN.31
1.1 ANZUCHT DER ORGANISMEN.31
1.1.1 KULTIVIERUNG VON E.COLI-STAENNNEN.31
1.1.2 ZELL- UND GEWEBEKUHUREN.31
1.1.3 KULTIVIERUNG DES BAKTERIOPHAGEN X.31
1.2 TRANSFORMATION DER VERWENDETEN ORGANISMEN.32
1.2.1 HERSTELLUNG TRANSFONNATIONSKOMPETENTER E.COLI-ZELLEN.32
1.2.2 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN E.COLI-ZELLEN.32
1.2.3 SELEKTION MITTELS LACZ-A-KOMPLEMENTATIOTRR.33
1.2.4 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON ZELLKULTURZELLEN MITTELS
CAPOYBES-PRAEZIPITATION.33
1.2.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON ZELLKULTURZELLEN MITTELS LIPOFECTAMIN
.33
1.2.6 LUZIFERASE REPORTERGEN-ANALYSEN.34
III
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/959943803
INHALTSVERZEICHNIS
1.3 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN. 34
1.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI. .34
1.3.2 ISOLIERUNG VON RNA AUS ZELLEN. 34
1.3.3 ISOLIERUNG FRAGMENTIERTER DNA AUS APOPTOTISEHEN ZELLEN. 35
1.3.4 ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA. 35
1.4 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON NUKLEINSAEUREN. 35
1.4.1 SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN. 35
1.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN. 35
1.4.3 LIGATION UND KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 36
1.4.4 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA UND PCR-PRODUKTCN.36
1.4.5 PCR-AMPLIFIZIERUNG VON DNA. 36
1.4.6 REVERSE TRANSKRIPTASE (RT)-POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR). 37
1.4.7 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT ZUFALLSHEXAMEREN. 37
1.4.8 RADIOAKTIVE MARKIERUNG DOPPELSTRAENGIGER OLIGONUKLEOTIDE. 37
1.5 ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN. 3G
1.5.1 GELELEKTROPHORESE VON DNA. 3G
1.5.2 GELELEKTROPHORESE VON RNA UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN
. 3G
1.5.3 TRANSFER VON DNA-FRAGMENTEN AUF NYLON (YYSOUTHERN BLOT").3G
1.5.4 TRANSFER VON RNA AUF NYLON (YYNORTHERN BLOT"). 39
1.5.5 COLONY-SCREENING. 39
1.5.6 PLAQUE-SCREENING
. 3G
1.5.7 FILTERHYBRIDISIERUNG
. 3G
1.5.8 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN
. 40
1.5.9 QUANTIFIZIERUNG FRAGMENTIERTER DNA. 40
1.5.10 DURCHSSUSSZYTOPHOTOMETRISCHE DNA-ANALYSE. 40
1.6 REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN.
4)
1.6.1 REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN DURCH PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION. 41
1.6.2 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELCN. 4J
1.6.3 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS POLYACIYLAMIDGELEN. 41
1.6.4 REINIGUNG RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-FRAGMENTE UND OLIGONUKLEOTIDE.
42
1.6.5 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN. 41
2 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.
2.1 GEWINNUNG VON PROTEINEN. 41
2.1.1 HERSTELLUNG VON GESAMTPROTEINEXTRAKTEN. 41
2.1.2 IN-VITRO-TRANSLATION. 4T
2.1.3 REINIGUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN. 43
2.2 ANALYSE VON PROTEINEN. 44
2.2.1 PROTEINBESTIMMUNG. 44
2.2.2 SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORCSE (SDS-PAGE). 44
2.2.3 DETEKTION VON PROTEINEN DURCH COOMASSIE BRILLIANT BLUE-FAERBUNG.44
2.2.4 TRANSFER VON PROTEINEN AUF NITROCELLULOSE (WESTERN BLOT). 44
2.2.5 DETEKTION VON PROTEINEN DURCH CHEMILUMINESZENZ. 45
2.2.6
GEL-SHIFT-ASSAY (EMSA). 43
IV
ERGEBNISSE _ _46
1 UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION VON AP-2 DURCH AP-2REP.46
1.1 KLONIERUNG DES GENOMISCHEN LOKUS VON HAP-2REP. 46
1.1.1 KLONIERUNG DES ZINKFINGERBEREICHES VON HAP-2REP
. 46
1.1.1.1 WEITERE CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP-CL. 47
1.1.1.2 NAEHERE CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP-C7. 49
1.1.2 KLONIERUNG N-TENNINALER SEQUENZEN VON HAP-2REP. 51
1.1.2.1 CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP-NL. 61
1.1.2.1 CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP-N2. 53
1.1.3 KLONIERUNG 5'-SEITIGER SEQUENZEN VON HAP-2REP. 55
1.1.3.1 CHARAKTERISIERUNG VON IIAP-2REP5'-2A. 55
1.1.3.2 CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP5 2.57
1.1.4 KLONIERUNG VON EXON V VON HAP-2RCP. 69
1.1.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER HAP-2REP-EV-KLONE. 59
1.1.5 EXON-LNTRON-STRUKTUR VON HAP2-REP. 61
IV
INHALTSVERZEICHNIS
1.2 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER CDNA VON HAP-2REP.63
1.2.1 ISOLIERUNG DER CDNA VON HAP-2REP.63
1.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER CDNA-KLONE.64
1.2.2.1 CHARAKTERISIERUNG DURCH SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG.64
1.2.2.2 CHARAKTERISIERUNG DURCH PCR.65
1.2.23 CHARAKTERISIERUNG DURCH SEQUENZIERUNG.66
1.2.2.4 DIE KODIERENDE SEQUENZ, VON HAP-2REP UND IHRE EIGENSCHAFTEN. 67
1.3 FUNKTIONSANALYTISCHE CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP.69
13.1 KLONIERUNG VON HAP-2REP IN EXPRESSIONSVEKTOREN.69
1.3.2 EXPRESSION VON HAP-2REP IN GEWEBE UND ZEILINIEN.71
1.3.3 DNA-BINDUNGSSPEZISSTAET VON HAP-2REP IM AP-2A-PROMOTOR.72
1.3.4 AP-2REP ALS TRANSKRIPTIONELKR REPRESSOR VON AP-2.74
13.4.1 LUCIFERASE REPORTER-ANALYSEN.74
13.4.2 ANALYSE TRANSFIZIERTER ZELLEN
.75
1.3.43 ANALYSE UNTRANSFIZIERTER ZELLEN.76
2 UNTERSUCHUNGEN ZU MOEGLICHEN FUNKTIONEN VON AP-2
.78
2.1 AP-2 UND PROGRAMMIERTER ZELLTOD.78
2.1.1 VORARBEITEN.78
2.1.1.1 PHAENOTYP AP-2-DEFIZ.IENTER MAEUSE.78
2. /. 1.2 AP-2 ALS REPRESSOR DER TRANSAKTIVIERUNG DURCH MYC.79
2.1.2 AUFBAU EINES IN VITRO-APOPTOSEMODELLS.79
2.1.2.1 DAS EXPERIMENTELLE SYSTEM.79
2.1.2.2 NACHWEIS FRAGMENTIERTER DNA DURCH "CELL DEATH DETECTION ELISA1
!IS".81
2.1.23 NACHWEIS FRAGMENTIERTER DNA DURCH AGAROSEGELEKTROPHORCSE.82
2.2 AP-2 UND ZELLZYKLUS.84
2.2.1 VORARBEITEN. 84
2.2.1.1 AP-2 UND P21
WAI/A1'.84
2.2.1.2 AP-2 UND CYCLIND2.85
2.2.2 AP-2 BINDET AN DEN PROMOTOR VON CVCLIN D2.85
2.2.3 AP-2 REPRIMIERT TRANSAKTIVIERUNG DURCH C-MYC.86
2.2.4 AP-2 UND CYCLIND2 IM ZELLZXKLUS. 87
2.2.4.1 SYNCHRONISATION VON ZELLEN
.89
2.2A.2 AP-2- UND CYCLIND2-SPIEGEI IN SYNCHRONISIERTEN ZELTEN.91
V DISKUSSION_94
1 STRUKTUR UND FUNKTION VON HAP-2REP.
94
1.1 CHARAKTERISIERUNG DES GENOMISCHEN LOKUS VON HAP-2REP.94
1.2 SEQUENZ- UND STRUKTUREIGENSCHAFTEN DER CDNA VON HAP-2REP.95
1.3 FUNKTIONSANALYTISCHE CHARAKTERISIERUNG VON HAP-2REP.96
1.3.1 EXPRESSIONSDATEN
.96
1.3.2 DNA-BINDUNGSSPEZISSTAET VON HAP-2REP.97
1.3.3 HAP-2REP ALS TRANSKRIPTIONELLER REPRESSOR VON AP-2.99
2 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON AP-2.102
2.1 AP-2 UND C-MYC-INDUZIERTE APOPTOSE.102
2.2 AP-2 UND ZELLZYKLUS.105
2.2.1 AP-2 IN DER DIFFERENZIERUNG.105
2.2.2 DIFFERENZIERUNG UND PROLIFERATION. 105
2.2.3 DER EINFLUSS VON AP-2 AUF PROLIFERATION UND ZELLZYKLUS
.106
VI ZUSAMMENFASSUNG 109
--
VII
LITERATURVERZEICHNIS_111
V |
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| title_short | Untersuchungen zu Regulation und Funktion des Transkriptionsfaktors AP-2 |
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| topic_facet | Genregulation Apoptosis Regulation Transkriptionsfaktor Hochschulschrift |
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