Immunologische Untersuchungen zur Expression von Nicht-Strukturproteinen des Kartoffel-Blattrollvirus (PLRV) mit spezifischen Antikörpern:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
1999
|
Schlagworte: | |
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Beschreibung: | IV, 124 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
EINLEITUNG
1
1.1
DAS
KARTOFFEL
BLATTROLLVIRUS
(PLRV)
.
.
.
1
1.2
DIE
PLRV-LESERASTER
0,1,2
UND
DIE
MINIMALPROTEINE
_
.
_
_
_
_
3
13
EXPRESSION
VON
PLRV-PROTEINEN
IN
FORM VON
FUSIONSPROTEINEN.
5
1.4
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
VIRALE
PROTEINE
.
7
13
PROBLEMSTELLUNG.
_
.
_
.
_
.
_
.
_
.
9
II
MATERIAL
UND
METHODEN.
13
H.
1
MATENAL
.YYYYYY.YY.YYYYYYYYYYYY.YY.YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
AAAAAAA
.
A
.
H
.
AAAAAAHA
.
AHAAAAAAAAAAAAAAHAAAAHAAAAAAAAAAAAA
.
AA
.
HAAAAAAAAAAAAAAAU
.
AAAAAA
.
H
.
13
11.1.1
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
13
11.1.2
ENZYME
UND
REAKTIONSKITS
.
13
II.
1.3
ANTIKOERPER
UND
ENZYMKONJUGIERTE
ANTI-ANTIKOERPER
.
13
II.
1.4
VERSUCHSTIERE
.
14
11.1.5
PFLANZEN
.
14
11.1.6
MYELOMZELLLINIEN
.
14
11.1.7
BAKTERIENSTAEMME
.
14
II.1.8
PLASMID-VEKTOREN
UND
PHAGENBIBLIOTHEKEN
.
15
II.
1.9
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
15
11.1.10
VERWENDETE
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
15
II.
1.11
GERAETE,
APPARATUREN
UND
ZUBEHOER.
.
15
IL2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
_
.
_
.
.
16
11.2.1
ANZUCHT
VON
E.COLI
UND
HERSTELLUNG
VON
STAMMKULTUREN
.
16
11.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
.
16
II.2.3
REINIGUNG,
PRAEZIPITATION
UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PLASMID-DNA
.
17
11.2.4
DNA-KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
17
11.2.4.1
RESTRIKTION
VON
DNA
.
I7
II.2.4.2
YYBLUNT
END
"
-LIGATION
.
18
11.2.4.3
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
E.COLI
.
18
II.2.5
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
18
11.2.6
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
DNA
.
19
11.2.6.
1
ANALYTISCHE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
19
II.2.6.2
PRAEPARATIVE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
UND
DNA-ISOLIERUNG
.
20
II.2.7
PROTEIN-RNA
BINDUNGSSTUDIEN
.
20
II.2.7.1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
.
20
II.2.7.2
NORTH-WESTEM
BLOT
.
21
II.2.7.3
EMSA
VON
PROTEIN-NUKLEINSAEURE
KOMPLEXEN
.
21
11.2.7.4
UV-QUERVEMETZUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
MIT
PROTEINEN
.
21
11.2.8
IN
VITRO
TRANSLATION
.
21
INHALSVERZEICHNIS
11.2.9
HERSTELLUNG
PLRV-TRANSGENER
KARTOFFELPFLANZEN
.
22
II.2.9.1
KULTIVIERUNG
VON
A.
TUMEFACIENS
UND
HERSTELLUNG
VON
STAMMKULTUREN
.
22
II.2.9.2
HERSTELLUNG
STICKSTOFFKOMPETENTER
A.
TUMEFACIENS
.
22
11.2.9.3
GEFRIERSCHOCK-TRANSFORMATION
VON
A.
TUMEFACIENS
.
23
11.2.9.4
KULTIVIERUNG
STERILER
KARTOFFELPFLANZEN
.
23
II.2.9.5
TRANSFORMATION
VON
KARTOFFELN
.
23
113
PROTEINCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN.
_
_
25
II.3.I
EXPRESSION
VON
GST
UND
GST-FUSIONSPROTEINEN
IN
E.
COLI
.
25
II.3.2
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
GST
UND
FUSIONSPROTEINEN
.
25
11.3.2.1
NATIVER
ZELLAUFSCHLUSS
DURCH
ULTRASCHALLBEHANDLUNG
.
25
11.3.2.2
REINIGUNG
LOESLICHER
GST-PROTEINE
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
25
II.3.2.3
REINIGUNG
UNLOESLICHER
GST-PROTEINE
.
25
11.3.2.4
UMPUFFERUNG
UND
KONZENTRIERUNG
DER
PROTEINE
DURCH
ULTRAFRLTRATION
.
26
11
.3.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
.
27
1
1.3.4
MESSUNG
DER
GST-AKTIVITAET
IM
FUSIONSPROTEIN
.
27
11.3.5
SDS-PAA
GELELEKTROPHORESE
UND
FAERBETECHNIKEN
.
27
11.3.5.1
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE-FAERBUNG
.
28
11.3.5.2
SILBERFAERBUNG
.
28
11.3.6
WESTEM-BLOT
(IMMUNO-BLOT)
.
28
II.3.7
IMMUNISIERUNG
VON
HUEHNERN
UND
MAEUSEN
.
28
II.3.7.
1
IMMUNISIERUNG
VON
HUEHNERN
.
29
II.3.7.2
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
.
29
II.3.8
ELISA
(ENZYME-LINKED-IMMUNOSORBENT-ASSAY)
.
29
11.3.9
ELISA
ZUR
BESTIMMUNG
DES
ANTIKOERPER-TITERS
IN
SERUM
ODER
EIGELB
.
30
11.3.10
REINIGUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
AUS
EIGELB
.
30
11.3.11
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
31
II.3.
11.
1
DURCHFUEHRUNG
DER
TIERISCHEN
ZELLKULTURARBEITEN
.
31
11.3.11.2
KRYOPRESERVATION
DER
TIERISCHEN
ZELLEN
.
32
II.3.
11.3
ISOLIERUNG
PERITONEALER
MAKROPHAGEN
.
32
11.3.11.4
GEWINNUNG
VON
MILZZELLEN
.
33
11.3.11.5
HERSTELLUNG
VON
HYBRIDOMAZELLEN
.
33
11.3.11.6
ELISA
ZUR
ANALYSE
DER
HYBRIDOMAKULTURUEBERSTAENDE
.
34
II.3.
11.7
VEREINZELUNG
YYMONOKLONALER
"
HYBRIDOMAKLONE
.
34
11.3.11.8
MASSENKULTIVIERUNG
VON
HYBRIDOMAZELLEN
ZUR
PRODUKTION
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
35
11.3.12
PROTEIN
A-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
35
11.3.13
REAKTIVITAET
GEREINIGTER
ANTIKOERPER
IM
ELISA
.
35
II.3.14
VERRINGERUNG
DER
KREUZREAKTIVITAET
GEREINIGTER
IGY
.
36
11.3.14.
1
IMMOBILISIERUNG
VON
PROTEINEN
AN
CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE*
.
36
11.3.14.2
ENTFERNUNG
GST-SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
.
37
II.3.14.3
ENTFERNUNG
PFLANZENSPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
11.3.15
CHARAKTERISIERUNG
AFFINITAETSGEREINIGTER
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
38
B.3.15.1
BIOSENSOR
MESSUNGEN
(OBERFLAECHEN
PLASMON
RESONANZ)
.
38
II.3.15.2
BESTIMMUNG
DES
ISOTYPS
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
:
.
38
II.3.
15.3
BESTIMMUNG
DER
AFFINITAETSKONSTANTEN
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
39
II.3.16
IMMUNOPRAEZIPITATION
IN
VITRO
TRANSFERIERTER
PROTEINE
.
39
II.3
.17
EPITOPBESTIMMUNG
MITTELS
YYPEPTIDE-DISPLAY
"
.
39
11.3.17.1
ANZUCHT
UND
PRAEPARATION
VON
M13-YYPEPTIDE-DISPLAY
"
-BIBLIOTHEKEN
.
40
11.3.17.2
TITRATION
DER
PHAGEN
.
40
11.3.17.3
ANREICHERUNG
SPEZIFISCH
BINDENDER
PHAGEN
(YYPANNING
"
)
.
40
II.3.17.4
PHAGEN-ELISA
.
41
11.3.17.5
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
PHAGEN
.
41
II.3.18
GEWINNUNG
VIRALER
UND
LOESLICHER
PROTEINE
AUS
PFFENZENBLAETTEM
.
41
III
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
43
III.
1
HERSTELLUNG
DER
PGEX-EXPRESSIONSKONSTRUKTE
.
43
HI.2
SEQUENZIERUNG
DER
PGEX-EXPRESSIONSKONSTRUKTEYY.YY.YY._.
45
HL3
EXPRESSION
DER
GST/PLRV-FUSIONSPROTEINE
IN
E.
COLI
.YYYYYY.YY~.YY.YY.YY.
45
HI.4
NATIVE
REINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
.YY.YYYY._._YYYY.
46
III.5
REINIGUNG
UNLOESLICHER
FUSIONSPROTEINE
.YY.YY.YY._.YY.YY.YY._.
47
III.6
RNA-BINDUNGSFOEHIGKEIT
DER
GST-FUSIONSPROTEINEYY.YY.YY.YY._.YY.YY.
48
II1.6.
1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
VIRALER
CDNA
.
49
11
1.6.2
EMSA
DER
PROTEIN-RNA-KOMPLEXE
.
50
11
1.6.2.1
ANALYSE
DER
SSRNA-BINDUNG
DES
PLRV-3MIN
.
51
I1I.6.2.2
ANALYSE
DER
DSRNA-BINDUNG
DES
PLRV-3MIN
.
52
1II.6.2.3
SSRNA/DSRNA-KOMPETITION
.
54
II1.6.3
UV-QUERVEMETZUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AN
DAS
PLRV-3MIN
.
55
IH.7
IMMUNISIERUNG
VON
HUEHNERN
UND
MAEUSEN
.
_
.
_
57
III.8
MONOKLONALE
PLRV-SPEZIFISCHE
ANTIKOERPER
.
_
.
60
III.9
REINIGUNG
DER
ANTIKOERPER.
_
.
_
.
62
111.9.1
REINIGUNG
DER
HUEHNERANTIKOERPER
DURCH
PEG-FAELLUNGEN
.
63
1II.9.2
SPEZIFITAET
UND
REAKTIVITAET
DER
HERGESTELLTEN
IGY
.
66
III.9.3
PRAEADSORPTION
PFLANZENSPEZIFISCHER
POLYKLONALER
IGY
.
66
III.9.4
IMMUNOPRAEZIPITATION
DES
IN
VITRO
TRANSFERIERTEN
PLRV-ORFO
.
66
111.9.5
PROTEIN
A-AFFINITAETSREINIGUNG
DER
MONOKLONALEN
MAUS-IGG
.
68
HI.10
CHARAKTERISIERUNG
DER
MONOKLONALEN
MAUS-ANTIKOERPER
.
69
III.
10.1
ABSCHAETZUNG
VON
AFFINITAETSKONSTANTEN
DER
MAK
IM
ELISA
.
69
III.
10.2
REAKTIVITAET
DER
ANTIKOERPER
IM
WESTERN-BLOT
.
71
INHALSVERZEICHNIS
III.
10.3
ISOTYPBESTIMMUNG
DER
MONOKLONALEN
MAUS-IGG
.
72
III.
10.4
OBERFAECHEN
PLASMON
RESONANZ
MESSUNGEN
AM
BIACOREYY
2000
BIOSENSOR
.
73
1II.10.5
INHIBITION DERGST-3MIN
RNA-BINDUNGSAKTIVITAET
DURCH
ANTIKOERPER
.
76
III.
10.6
LOKALISATION
UND
BESTIMMUNG
DES
MAK
A-GST-3MIN-EPITOPS
.
77
III.
10.6.1
ANZUCHT
DER
YYPEPTIDE-DISPLAY
"
-BIBLIOTHEKEN
.
78
III.
10.6.2
ANREICHERUNG
MAK-SPEZIFISCHER
PHAGEN
(YYPANNING
"
)
.
78
III.
10.6.3
SEQUENZIERUNG
DER
PHAGEMID-DNA
UND
ANALYSE
DER
PEPTID-MOTIVE
.
78
III.
10.7
CHARAKTERISTIKA
ALLER
SPEZIFISCHEN
MAK
.
81
HI.11
LESERASTERWECHSEL
AM
STOPP-KODON
DES
PLRV2MIN
IN
E.
COLI.
-
.
83
111.12
UNTERSUCHUNGEN
AN
INFIZIERTEN
ODER
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
85
III.12.1
PHAENOTYP
PLRV-ORFO-TRANSGENER
KARTOFFELN
.
86
III.
12.2
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
PLRV-ORFO
IN
PFLANZEN
.
89
III.
12.3
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
PLRV-ORF1
(PI)
IN
PFLANZEN
.
92
III.
12.4
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
DES
PLRV-ORF1
IN
INFIZIERTEN
PFLANZEN
.
94
IV
ABSCHLUSSDISKUSSION
UND
AUSBLICK
.
97
IV.
1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
GST-FUSIONSPROTEINE
_
_
_
97
IV.2
IMMUNISIERUNGEN
MIT
LOESLICHEN
UND
UNLOESLICHEN
ANTIGENEN
.
_
99
IV3
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANTIKOERPER.
100
IV.4
CHARAKTERISIERUNG
VIRALER
PROTEINE
DURCH
ANTIKOERPER
.
102
IVA.
1
EIGENSCHAFTEN
DER
RNA-BINDUNG
DES
GST-3MIN
.
102
IV.4.2
DER
LESERASTERWECHSEL
DES
PLRV-2MIN
.
103
IV.4.3
WIRTSSPEZIFITAET
UND
SYMPTOME
DURCH
PLRV-ORFO
.
104
IV.4.4
DIE
IN
VIVO
PROZESSIERUNG
DES
PLRV-ORF1
(PI)
ZUM
VPG
.
106
IV.
5
WEITERFUEHRENDE
ARBEITEN
.
.
108
V
ZUSAMMENFASSUNG.
111
VI
LITERATURVERZEICHNIS.
113
VI.1
LITERATUR.
_
.
113
VI.2
EIGENE
VEROEFFENTLICHUNGEN.
-
.
_
.
_
_
121
VII
ABKUERZUNGEN
.123 |
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