Reinigung und biochemische Charakterisierung einer thermostabilen Alpha-Amylase aus Pyrococcus woesei nach Klonierung und Expression in Escherichia coli und Halomonas elongata:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
---|---|
Format: | Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
1999
|
Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | Hamburg-Harburg, Techn. Univ., Diss., 1999 |
Beschreibung: | VII, 137 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.VI-VII
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
EXTREMOZYME
.
1
1.2
STAERKE
:
ZUSAMMENSETZUNG
UND
ENZYMATISCH
KATALYSIERTER
ABBAU
DURCH
STAERKE-HYDROLASEN
.
2
1.3
KLASSIFIZIERUNG
DER
A-AMY
LASEN
.
3
1.4
STAERKE-HYDROLASEN
AUS
HYPERTHERMOPHILEN
.
5
1.5
ANWENDUNG
VON
EXTREMOZYMEN
.
12
1.5.1
EINSATZ
THERMOSTABILER
STAERKE-HYDROLASEN
.
13
1.6
PROTEIN-ENGINEERING
UND
KLONIERUNG
-
STRATEGIEN
ZUR
PRODUKTION
AKTIVER
THERMOZYME
.
15
1.7
FERMENTATIONSMETHODEN
ZUR
ERHOEHUNG
DER
PRODUKTIVITAET
UND
DES
WACHSTUMS
REKOMBINANTER
E.
COLI
STAEMME
.
17
1.8
AGGREGATEN
REKOMBINANTER
PROTEINE:
VOR
UND
NACHTEILE
VON
INCLUSION
BODIES
.
18
1.9
ZIELE
DER
ARBEIT
.
20
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
21
2.1
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
21
2.2
CHEMIKALIEN,
GASE
UND
ENZYME
.
23
2.3
PUFFER
UND
STAMMLOESUNGEN
.
23
2.4
ORGANISMEN
.
25
2.5
PLASMIDE
UND
OLIGONUKLEOTIDE
.
25
2.5.1
PLASMIDE
.
25
2.5.2
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
2.6
ZELLANZUCHT
.
26
2.6.1
ANAEROBE
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
.
26
2.6.2
AEROBE
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
.
28
2.7
STAMMHALTUNG
.
29
2.8
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
PYROCOCCUS
WOESEI
.
30
2.9
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
.
30
2.10
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
IN
LOESUNGEN
.
31
2.11
AMPLIFIZIERUNG
DES
A-AMYLASE-GENS
AUS
P.
WOESEI
(PWA)
MITTELS
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION;
PCR)
.
31
2.11.1
PRINZIP
DER
PCR
.
31
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.11.2
AMPLIFIZIERUNG
DES
PWA-GENS
.
32
2.12
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
PWA-GENS
IN
DAS
PET-15B
EXPRESSIONSSYSTEM
.
33
2.12.1
BESCHREIBUNG
DES
PET
1
5B
VEKTORS
.
33
2.12.2
DER
E.
COLI
BL21(DE3)
KLONIERUNGS
UND
EXPRESSIONSSTAMM
.
35
2.12.3
AUFREINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
35
2.12.4
VEKTORPRAEPARATION
.
35
2.12.5
INSERT
PRAEPARATION
.
36
2.12.6
LIGATION
DER
RESTRINGIERTEN
DNA-FRAGMENTE
MIT
T4-DNA-LIGASE
.
36
2.12.7
TRANSFORMATION
(NISHIMURA
ET
AL.,
1990)
IN.
CO/IBL21(DE3)
.
37
2.12.8
NACHWEIS
POSITIVER
KLONE
DURCH
KOLONIE-PCR
UND
RESTRIKTIONSANALYSE
.
38
2.12.9
EXPRESSION
.
38
2.13
FERMENTATION
DES
REKOMBINANTEN
EXPRESSIONSSTAMMES
E.
COLI
BL21(DE3)
UND
PRODUKTION
DER
REKOMBINANTEN
A
AMYLASE
(PWA)
.
39
2.13.1
OPTIMIERUNG
DER
MEDIENZUSAMMENSETZUNG
IN
SCHUETTELKULTUREN
.
39
2.13.2
FED-BATCH
FERMENTATION
NACH
DER
BALANCED
DO-STAT
STRATEGIE
IM
CHEMOSTATEN
.
41
2.13.3
FED-BATCH
FERMENTATION
NACH
DER
BALANCED
DO-STAT
STRATEGIE
IM
DIALYSE-REAKTOR
.
42
2.14
FERMENTATIONSANALYTIK
.
44
2.14.1
WACHSTUMSBESTIMMUNG
.
45
2.14.2
ACETAT-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
45
2.14.3
ERMITTLUNG
DER
GLUCOSE-KONZENTRATION
.
46
2.14.4
BESTIMMUNG
DER
A-AMYLASE-PRODUKTION
.
46
2.15
KOEXPRESSION
DER
FUER
ECTOIN
UND
O-AMYLASE
KODIERENDEN
GENE
IN
E.
COLI
BL21(DE3)
.
46
2.15.1
UEBERPRUEFUNG
DER
TRANSFORMATION
DURCH
KOLONIE-PCR-ANALYSE
.
47
2.15.2
PARALLELE
EXPRESSION
DER
AMYLASE
UND
ECTOIN-GENE
IN
E.
COLI
.
47
2.15.3
BESTIMMUNG
DER
A-AMYLASEAKTIVITAET
UND
DER
AGGREGATION
.
48
2.16
EXPRESSION
UND
AGGREGATION
DER
PWA
IN
ANWESENHEIT
VON
KOMPATIBLEN
SOLUTEN
.
48
2.16.1
EXPRESSION
DES
PWA-GENS
IN
ECTOINHALTIGEM
MEDIUM
.
49
2.16.2
EXPRESSION
DES
PWA-GENS
IN
BETAINHALTIGEM
MEDIUM
.
49
2.17
EXPRESSION
DES
PWA-GENS
IN
HALOMONAS
ELONGATA
.
49
2.18
TEMPERATUR
UND
PH-OPTIMUM
DER
IN
H.
ELONGATA
PI
PRODUZIERTEN
PWA
.
50
2.19
ZELLEMTE
UND
ZOLLAGERUNG
.
50
2.20
ZELLAUFSCHLUSS
.
50
2.21
PROTEINBESTIMMUNG
.
51
2.21.1
PROTEINBESTIMMUNG
(BRADFORD
1976,
MODIFIZIERT)
.
51
2.21.2
PROTEINBESTIMMUNG
(GILL
&
VON
HIPPEL
1989)
.
51
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.22
GELELEKTROPHORETISCHE
TRENNMETHODEN
.
52
2.22.1
DISKONTINUIERLICHE
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
(LAEMMLI
1970)
.
52
2.22.2
NATIVE
POROSITAETSGRADIENTEN-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
.
53
2.22.3
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
54
2.22.4
AKTIVITAETSGELE
(ZYMOGRAMME)
.
55
2.23
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IM
GEL
.
55
2.23.1
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
(WEBER
UND
OSBORN
1969,
MODIFIZIERT)
.
55
2.23.2
SILBER-FAERBUNG
(BLUM
1987)
.
55
2.23.3
FAERBUNG
VON
ZYMOGRAMMEN
MIT
JOD-JODKALIUM
.
56
2.24
BESTIMMUNG
DER
AMYLOYTISCHEN
ENZYMAKTIVITAET
(BEMFELD
1955)
.
56
2.24.1
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAET
AGGREGIERT
VORLIEGENDER
PWA
.
57
2.25
UMPUFFERUNG
UND
ENTSALZUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
58
2.25.1
TRENNUNG
VON
KOMPONENTEN
IN
PROTEINLOESUNGEN
AN
SEPHADEX
G-25
.
58
2252
DIALYSE
.
58
2.26
HERSTELLUNG
DER
ROHEXTRAKTE
.
58
2.27
SOLUBILISIERUNG
UND
EXTRAKTION
DER
AGGREGIERTEN
A-AMYLASE
IN
GEGENWART
VON
GLYZERIN
.
59
2.28
REINIGUNG
DER
AMYLASE
UEBER
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
PHENYL-SUPEROSE
.
59
2.29
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
A-AMYLASE
.
60
2.29.1
TEMPERATUR
UND
PH-OPTIMUM
.
61
2.29.2
THERMOSTABILITAET
.
61
2.29.3
EINFLUSS
VON
METALLIONEN,
POLYOLEN
UND
ANDEREN
REAGENZIEN
AUF
DIE
ENZYMAKTIVITAET
.
61
2.29.4
SUBSTRATSPEKTRUM
UND
HYDROLYSEPRODUKTE
DER
A-AMYLASE
.
62
2.30
SEQUENZVERGLEICHE
.
62
3.
ERGEBNISSE
.
.
.
-------------------
63
3.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
FUER
EINE
A-AMYLASE
AUS
P.
WOESEI
KODIERENDEN
GENS
(PWA)
IN
E.
COLI
BL21(DE3)
.
63
3.2
VERSUCHE
ZUR
WACHSTUMSOPTIMIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
E.
COLI
BL21(DE3)
AUF
DEFINIERTEN
UND
KOMPLEXEN
MEDIEN
IN
SCHUETTELKULTUREN
.
67
3.3
WACHSTUM
UND
AMYLASEPRODUKTION
WAEHREND
DER
FED-BATCH-KULTIVIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
E.
COLI
BL21(DE3)
NACH
DER
BALANCED
DO-STAT
STRATEGIE
.
70
3.3.1
WACHSTUM
UND
AMYLASEPRODUKTION
IM
CHEMOSTATEN
.
71
3.3.2
WACHSTUM
UND
AMYLASEPRODUKTION
IM
DIALYSE-REAKTOR
.
74
3.4
VERSUCHE
ZUR
ERHOEHUNG
DER
LOESLICHKEIT
DER
PWA
WAEHREND
DER
EXPRESSION
.
76
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1
KOEXPRESSION
DER
FUER
ECTOIN
UND
PWA
KODIERENDEN
GENE
IN
E.
COLI
BL21(DE3)
.
76
3.4.2
EXPRESSION
IN
ANWESENHEIT
KOMPATIBLER
SOLUTE
.
78
3.4.3
EXPRESSION
DES
PWA-GENS
IN
HALOMONAS
ELONGATA
.
80
3.5
REINIGUNG
DER
PWA
.
81
3.5.1
HERSTELLUNG
DES
ROHEXTRAKTES
.
81
3.5.2
SOLUBILISIERUNG
UND
EXTRAKTION
DER
PWA
AUS
DEM
AGGREGATIONSVERBAND
.
81
3.5.3
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
PHENYL-SUPEROSE
.
82
3.5.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
REINIGUNG
.
83
3.6
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
PWA
.
84
3.6.1
ABSCHAETZUNG
DER
MOLEKULARMASSE
.
85
3.6.2
PH-OPTIMUM
.
86
3.6.3
TEMPERATUROPTIMUM
.
87
3.6.4
TEMPERATURSTABILITAET
.
88
3.6.5
TEMPERATURSTABILITAET
IN
ABHAENGIGKEIT
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
89
3.6.6
EINFLUSS
VON
METALLIONEN
UND
REAGENZIEN
.
90
3.6.7
EINFLUSS
VON
POLYALKOHOLEN
.
91
3.6.8
EINFLUSS
VON
DMSO
.
94
3.6.9
MUSTER
DER
HYDROLYSEPRODUKTE
VERSCHIEDENER
SUBSTRATE
NACH
INKUBATION
MIT
DER
PWA
.
94
3.7
PRIMAERSEQUENZ-VERGLEICH
DER
REKOMBINANTEN
A-AMYLASE
AUS
P.
WOESEI
MIT
SEQUENZEN
REKOMBINANTER
A-AMYLASEN
AUS
HYPERTHERMOPHILEN
ARCHAEA
DER
ORDNUNG
THERMOCOCCALES
.
96
4.
DISKUSSION
_
.
----
.
-
.
-
.
-
.
----
.99
4.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DER
A-AMYLASE
AUS
PYROCOCCUS
WOESEI
(PWA)
.
99
4.2
FERMENTATION
UND
PRODUKTION
DER
REKOMBINANTEN
PWA
.
100
4.2.1
OPTIMIERUNG
DER
MEDIENZUSAMMENSETZUNG
.
100
4.2.2
ACETATBILDUNG,
ZELLAUSBEUTE
UND
AMYLASEPRODUKTION
WAEHREND
DER
FED-BATCH
FERMENTATION
IM
FOLIENFERMENTER
UND
IM
DIALYSE-FOLIENFERMENTER
.
101
4.3
AGGREGATION
DER
REKOMBINANTEN
A-AMYLASE
WAEHREND
DER
PWA-GENEXPRESSION
.
103
4.4
VERSUCHE
ZUR
VERRINGERUNG
VON
PWA-AGGREGATION
WAEHREND
DER
EXPRESSION
.
105
4.4.1
TEMPERATUR
.
105
4.4.2
KOMPATIBLE
SOLUTE
.
106
4.4.3
EXPRESSION
IN
HALOMONAS
ELONGATA
.
107
4.5
SOLUBILISIERUNG
DER
PWA
AUS
DEM
AGGREGATIONSVERBAND
.
108
4.6
REINIGUNG
DER
PWA
.
109
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.7
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
PWA
.
111
4.7.1
ABSCHAETZUNG
DER
MOLEKULARMASSE
.
111
4.7.2
PH-OPTIMUM
.
112
4.7.3
TEMPERATUR-OPTIMUM
.
113
4.7.4
TEMPERATURSTABILITAET
.
114
4.7.5
DIVALENTE
KATIONEN
UND
REAGENZIEN
.
116
4.7.6
SUBSTRATSPEZIFITAET
UND
HYDROLYSEPRODUKTE
.
117
4.8
AMINOSAEURESEQUENZ
UND
BIOCHEMISCHER
VERGLEICH
DER
PWA
MIT
ZWEI
REKOMBINANTEN,
EXTRAZELLULAEREN
A-AMYLASEN
AUS
ARCHAEA
DER
ORDNUNG
THERMOCOCCALES
.
118
4.9
VERGLEICH
DER
KONSERVIERTEN
REGIONEN
MIT
WEITEREN
ENZYMEN
DER
GLYKOSYL-HYDROLASE-FAMILIE
13
.
120
5.
ZUSAMMENFASSUNG
_
_
_
.
----
.
---------
.
122
6.
LITERATURVERZEICHNIS.
_
_
.
---------
.124 |
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