Semiquantitative Untersuchungen zur Verteilung der cAMP-Phosphodiesterase-Familien 1 und 4 in Normalgeweben, entsprechenden Tumorgeweben und Tumorzellinien sowie Identifizierung einer bislang unbekannten Spleißvariante der Subfamilie PDE4C:
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| Format: | Buch |
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
SECOND
MESSENGER.
VERMITTLER
VON
EXTRAZELLULAEREN
SIGNALEN
UND
.
SPEZIFISCHEN
ZELLANTWORTEN
.
1
1.2
DER
CAMP-SIGNALWEG:
VIELFALT,
KOMPLEXIZITAET
UND
INTERAKTION
MIT
.
TUMORRELEVANTEN
SIGNALWEGEN
.
2
1.3
CAMP
UND
CGMP-SPEZIFISCHE
PHOSPHODIESTERASEN
.
5
1.3.1
EINTEILUNG
DER
CAMP
UND
CGMP-SPEZIFISCHEN
.
PHOSPHODIESTERASEN
.
5
1.3.2
STRUKTUR
DER
CAMP-SPEZIFISCHEN
PHOSPHODIESTERASEN
.
6
1.4
REGULIERUNG
DER
PHOSPHODIESTERASEN
.
8
1.4.1
REGULATION
DER
KALZIUM/CALMODULIN-SENSITIVEN
.
PHOSPHODIESTERASEN
(CA/CAM
PDE1)
.
8
1.4.2
REGULATION
DER
CAMP-SPEZIFISCHEN
PHOSPHODIESTERASEN
(PDE4)
.
9
1.5.
VORKOMMEN
VON
CAMP-PHOSPHODIESTERASEN
IN
ZELLEN
UND
.
GEWEBEN
.
10
2
FRAGESTELLUNG
.
14
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
15
3.1
MATERIAL
.
15
3.1.1
GERAETE
.
15
3.1.2
SOFTWARE
.
15
3.1.3
VERBRAUCHSMATERIAL
.
16
3.1.4
REAGENZIEN
.
16
3.1.4.1
LOESUNGEN
.
16
3.1.4.2
SUBSTANZEN
.
17
3.1.5
ENZYME
.
17
3.1.6
KITS
.
18
3.1.7
DNA
UND
PROTEINSTANDARDS
.
18
3.1.8
RNAUNDCDNA
.
18
3.1.9
ANTIKOERPER
.
19
3.1.10
VEKTOREN
.
19
3.1.11
ZELLINIEN
.
19
3.1.12
STANDARDPUFFER
.
20
3.1.13
ZELLKULTURMEDIEN
.
20
3.1.14
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
21
3.1.14.1
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
YYKLASSISCHE
"
PCR
.
21
3.1.14.2
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
ECHTZEIT-PCR
.
22
3.1.14.3
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
RACE-PCR,
DIE
GENOMISCHE
PCR
.
DIE
SDM-PCR
UND
DIE
FULL-LENGTH-PCR
.
23
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.2
METHODEN
.
24
3.2.1
METHODEN
ZUR
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
ZELLEN
.
24
3.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
.
24
3.2.1.2
ISOLIERUNG
VON
MRNA
.
25
3.2.1.3
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
.
26
3.2.2
RNA-VERDAU
.
26
3.2.3
REVERSE
TRANSKRIPTION:
SYNTHESE
VON
CDNA
AUS
RNA
.
27
3.2.4
PCR-METHODEN
ZUM
NACHWEIS
VON
PHOSPHODIESTERASE
.
TRANSKRIPTEN
.
28
3.2.4.1
YYKLASSISCHE
"
POLYMERASE-KETTENREAKTION
ZUM
QUALITATIVEN
.
NACHWEIS
VON
PHOSPHODIESTERASE-TRANSKRIPTEN
.
28
3.2.4.2
ECHTZEIT-PCR
FUER
DIE
QUANTIFIZIERUNG
VON
PHOSPHODIESTERASE
.
TRANSKRIPTEN
.
30
3.2.4.2.
1
DAS
PRINZIP
DER
ECHTZEIT
(REA/-77ME)-PCR
.
30
3.2.4.2.2
AUSWERTUNG
DER
ROHDATEN
.
31
3.2.4.2.3
ECHTZEIT-PCR-PARAMETER
.
32
3.2.4.3
RACE-PCR
(RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS)
.
34
3.2.5
SDM
(SITE
DIRECTED
MUTAGENESIS)
.
35
3.2.6
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
37
3.2.7
EXTRAKTION
UND
AUFREINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
.
AGAROSEGELEN
.
37
3.2.8
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
38
3.2.9
METHODEN
FUER
DIE
REKOMBINANTE
EXPRESSION
VON
PDE4C-644
IM
.
BACULOVIRUS/INSEKTENZELLEN-EXPRESSIONSSYSTEM
.
39
3.2.9.1
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
UND
EXPRESSION
VON
.
PDE4C-644
.
39
3.2.9.2
VIRALER
PLAQUE
ASSAY
.
42
3.2.9.3
METHODEN
ZUM
NACHWEIS
DER
REKOMBINANT
IN
INSEKTENZELLEN
.
EXPRIMIERTEN
PHOSPHODIESTERASE
PDE4C-644
.
43
3.2.9.3.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
43
3.2.9.3.2
ELEKTRO-SS/OTT/NG
.
43
3.2.9.3.3
WESTERN-SS/OFT/NG
.
44
3.2.9.3.4
PHOSPHODIESTERASE
[
3
H]-CAMP
SCINTILLATION
PROXIMITY
ASSAY
(SPA).
44
3.2.10
SEPARATION
VON
MONONUKLEAEREN
ZELLEN
DES
PERIPHEREN
BLUTES
.
46
3.2.11
STIMULATION
VON
PBMC
MIT
POKEWEED
MITOGEN
(PWM)
.
46
INHALTSVERZEICHNIS
III
4
ERGEBNISSE
.
47
4.1
MRNA-EXPRESSION
VON
CAMP-PHOSPHODIESTERASEN
.
IN
NORMALGEWEBEN,
TUMORGEWEBEN
UND
TUMORZELLINIEN
.
47
4.1.1
PCR-STRATEGIEN
ZUM
NACHWEIS
VON
CAMP-PDES
.
47
4.1.2
YYKLASSISCHE
"
PCR
ZUM
NACHWEIS
DER
SUBFAMILIEN
VON
.
PDE1
(A,B,C),
PDE4
(A,B,C,D)
UND
PDE7
(A)
.
48
4.1.3
ECHTZEIT-PCR
ZUM
SEMIQUANTITATIVEN
NACHWEIS
DER
PDE1
UND
.
PDE4-SUBFAMILIEN
.
51
4.1.3.1
ECHTZEIT-PCR:
UEBERPRUEFUNG
DER
PCR-PRODUKTE
UND
.
FESTLEGUNG
DER
ANALYSEMETHODE
.
51
4.1.3.2
RELATIVE
EXPRESSION
VON
PDE1
(A,B,C)
UND
.
PDE4
(A,B,C,D)-MRNA
IN
HUMANEN
NORMALGEWEBEN
.
54
4.1.3.2.1
RELATIVE
EXPRESSION
VON
PDE1-MRNA
IN
NORMALGEWEBEN
.
54
4.1.3.2.2
RELATIVE
EXPRESSION
VON
PDE4-MRNA
IN
NORMALGEWEBEN
.
56
4.1.3.3
VERGLEICH
DER
RELATIVEN
EXPRESSIONEN
VON
PDE1
(A.B.C)
UND
.
PDE4
(A,B,C,D)
MRNA-TRANSKRIPTEN
IN
NORMALGEWEBEN,
.
TUMORGEWEBEN
UND
TUMORZELLINIEN
HUMANEN
URSPRUNGS
.
56
4.1.3.3.1
VERGLEICH
DER
RELATIVEN
EXPRESSIONEN
VON
PDE1-MRNA
IN
.
NORMALGEWEBEN,
TUMORGEWEBEN
UND
TUMORZELLINIEN
.
56
4.1.3.3.2
VERGLEICH
DER
RELATIVEN
EXPRESSIONEN
VON
PDE4-TRANSKRIPTEN
IN
.
NORMALGEWEBEN,
TUMORGEWEBEN
UND
TUMORZELLINIEN
.
61
4.2
UEBERPRUEFUNG
DER
ZUVERLAESSIGKEIT
VON
BETA-AKTIN-NORMALISIERUNGEN
.
66
4.3
IDENTIFIZIERUNG
EINER
BISLANG
UNBEKANNTEN
PDE4C-VARIANTE
IN
DER
.
HUMANEN
B-LYMPHOM
ZELLINIE
RAJI
.
69
4.3.1
STRATEGIE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
DES
TRANSKRIPTS:
5'-RACE-PCR
.
69
4.3.2
SEQUENZIERUNG
DER
FTR//-/ENGFH-PCR-PRODUKTE
.
73
4.3.3
CDNA-SEQUENZ
UND
DAVON
ABGELEITETE
AS-SEQUENZ
DES
BISLANG
.
UNBEKANNTEN
PDE4C-TRANSKRIPTS
.
74
4.3.4
VERGLEICH
DER
SEQUENZ
VON
PDE4C-644
MIT
BEREITS
BEKANNTEN
.
PDE4C-VARIANTEN
.
74
4.3.5
UNTERSUCHUNG
DER
5'
GELEGENEN
SPLEISSREGION
.
77
4.3.6
REKOMBINANTE
EXPRESSION
VON
PDE4C-644
.
79
4.3.6.1
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
UND
EXPRESSION
VON
.
PDE4C-644
IN
SF9-INSEKTENZELLEN
.
80
4.3.6.2
BESTIMMUNG
DER
INFEKTIOSITAET
DER
VIRALEN
STAMMLOESUNG:
.
VIRALER
PLAQUE
ASSAY
.
82
4.3.6.3
EXPRESSIONSKINETIK
VON
PDE4C-644
IN
SF9
UND
HI5-INSEKTENZELLEN.
UND
UEBERPRUEFUNG
DER
CAMP-HYDROLYSEAKTIVITAET
DES
REKOMBINANTEN
.
PROTEINS
.
83
4.3.6.4
EINFLUSS
VON
PHOSPHODIESTERASE-INHIBITOREN
AUF
DIE
CAMP
.
HYDROLYSEAKTIVITAET
DER
REKOMBINANT
EXPRIMIERTEN
PDE4C-644
.
86
4.3.7
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
VORKOMMEN
VON
PDE4C-644
.
88
4.4
SEMIQUANTITATIVE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
VON
.
PDE4-TRANSKRIPTEN
IN
MITOGEN-STIMULIERTEN
PBMC
.
89
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5
DISKUSSION
.
90
5.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MRNA-VERTEILUNG
CAMP-HYDROLYSIERENDER
.
PHOSPHODIESTERASEN
IN
NORMALGEWEBEN,
ENTSPRECHENDEN
.
TUMORGEWEBEN
UND
TUMORZELLINIEN
.
91
5.1.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MRNA-VERTEILUNG
VON
PDE1,
PDE4
UND
PDE7
.
IN
PBMC
UND
IN
MALIGNEN
ZELLEN
LYMPHOIDEN
UND
NICHT-LYMPHOIDEN.
URSPRUNGS
MIT
HILFE
DER
YYKLASSISCHEN
"
PCR
.
91
5.1.2
SEMIQUANTITATIVE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MRNA-EXPRESSION
VON
PDE1
.
UND
PDE4
IN
NORMALGEWEBEN,
ENTSPRECHENDEN
TUMORGEWEBEN
.
UND
TUMORZELLINIEN
MIT
HILFE
DER
ECHTZEIT-PCR
.
93
5.1.2.1
VERTEILUNG
VON
PDE1
UND
PDE4-TRANSKRIPTEN
IN
HUMANEN
NORMALGEWEBEN
.
93
5.1.2.2
VERTEILUNG
VON
PDE1
UND
PDE4-MRNA-TRANSKRIPTEN
IN
HUMANEN
.
NORMALGEWEBEN,
ENTSPRECHENDEN
TUMORGEWEBEN
UND
.
TUMORZELLINIEN
.
95
5.1.2.2.1
VERGLEICH
VON
NORMALGEWEBEN
MIT
TUMORGEWEBEN
.
95
5.1.2.2.2
VERGLEICH
VON
NORMALGEWEBEN
MIT
TUMORZELLINIEN
.
96
5.1.2.3
BEURTEILUNG
DER
METHODIK:
ECHTZEIT
(REA/-T/ME)-PCR
.
97
5.2
IDENTIFIZIERUNG
EINES
BISLANG
UNBEKANNTEN
TRANSKRIPTS
DES
.
PHOSPHODIESTERASE-GENS
PDE4C
IN
DER
HUMANEN
B-LYMPHOM
.
ZELLINIE
RAJI:
PDE4C-644
.
99
5.2.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
PDE4C-644
.
99
5.2.2
VERGLEICH
VON
PDE4C-644
MIT
BEKANNTEN
PHOSPHODIESTERASEN
DER
.
FAMILIE
PDE4
.
100
5.2.3
AUTHENTIZITAET
VON
PDE4C-644
.
101
5.2.4
REKOMBINANTE
EXPRESSION
DER
AUS
DER
B-LYMPHOM
ZELLINIE
RAJI
.
ISOLIERTEN
PDE4C-644
.
105
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
111
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
113 |
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| spelling | Büttner, Ralf Verfasser aut Semiquantitative Untersuchungen zur Verteilung der cAMP-Phosphodiesterase-Familien 1 und 4 in Normalgeweben, entsprechenden Tumorgeweben und Tumorzellinien sowie Identifizierung einer bislang unbekannten Spleißvariante der Subfamilie PDE4C von Ralf Büttner 1999 VII, 125 Bl. Ill., graph. Darst. : 21 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2000 Tumorzelle (DE-588)4186433-5 gnd rswk-swf Phosphodiesterasen (DE-588)4174389-1 gnd rswk-swf Cyclo-AMP (DE-588)4148493-9 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Tumorzelle (DE-588)4186433-5 s Phosphodiesterasen (DE-588)4174389-1 s Cyclo-AMP (DE-588)4148493-9 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=009018468&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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