Identifizierung und Charakterisierung von substraten der Protein-Tyrosinphosphatase SHP-1 in Epithelzellen:
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2000
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| Beschreibung: | Jena, Univ., Diss., 2000 |
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INHALT
SEITE
1. EINLEITUNG
1.1. DER EPIDERMALE WACHSTUMSFAKTOR=REZEPTOR 1
1.2. PROTEIN-TYROSINPHOSPHATASEN 6
1.3. SHP-1 - STRUKTUR UND FUNKTION 11
1.3.1. TYROSINPHOSPHATASEN MIT SH2-DOMAENEN 11
1.3.2. SHP-1 - EXPRESSIONSMUSTER UND "KNOCKOUT"-MAEUSE 11
1.3.3. SHP-1 - EIN NEGATIVER REGULATOR VON HAEMATOPOIETISCHEN SIGNAL
WEGEN 14
1.3.4. SHP-1 - ROLLE IN EPITHELZELLEN 15
1.3.5. SHP-1 - REGULATION DER KATALYTISCHEN AKTIVITAET 16
1.4. MOEGLICHE TARGETS FUER SHP-1 IN EPITHELZELLEN 20
1.4.1. PL20CTN 20
1.4.2. VAV2 22
1.4.3. ROS 24
1.5. DAS TET-OFF-SYSTEM 25
2. ZIELSTELLUNGEN DER ARBEIT
27
3 . MATERIAL UND METHODEN
3.1. MATERIAL 28
3.1.1. ETABLIERTE EUKARYOTISCHE ZELLINIEN 28
3.1.2. BAKTERIENSTAEMME
(E. COLI) 28
3.1.3. TIERE 28
3.1.4. ANTIKOERPER 29
3.1.5. EXPRESSIONSPLASMIDE 30
3.1.6. OLIGONUKLEOTIDE 32
3.1.7. PEPTIDE 33
3.1.8. ANDERE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 34
3.2. METHODEN 35
3.2.1. KONSTRUKTION DER BAKTERIELLEN EXPRESSIONSPLASMIDE 35
3.2.2. KONSTRUKTION EINES EUKARYOTISCHEN EXPRESSIONSPLASMIDES FUER VAV2
MIT 35
HA-EPITPOP
3.2.3. HERSTELLUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN IN BAKTERIEN 35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.2.4. HERSTELLUNG GST-FREIER SHP-1 36
3.2.5. PHOSPHATASE-AKTIVITAETSVERSUCHE 37
3.2.6. TRANSIENTE TRANSFEKTION VON 293-ZELLEN 37
3.2.7. IMMUNOPRAEZIPITATION 38
3.2.8. IMMUNOBLOT 38
3.2.9. ASSOZIATIONSVERSUCHE MIT EGFR-PUNKTMUTANTEN, KOTRANSFEKTION UND
39
DEPHOSPHORYLIERUNGSASSAYS
3.2.10.
LN VITRO-KINASE-ASSAYS 39
3.2.11. SEQUENTIELLE IMMUNO- UND AFFINITAETSPRAEZIPITATION 40
3.2.12. KOMPETITION DER EGFR-SHP-1-INTERAKTION DURCH PHOSPHOPEPTIDE 41
3.2.13. GST-PULLDOWN, 2D-GELELEKTROPHORESE 41
3.2.14. REINIGUNG VON PP 100 (PL20CTN) AUS A431-ZELLEN 43
3.2.15. IN-GEL-VERDAU 43
3.2.16. ZELLBIOLOGISCHE ASSAYS 44
3.2.17. VERSUCHE MIT ME-V-MAEUSEN, AUFARBEITUNG VON ORGANEN ._ 45
3.2.18. PUFFER UND LOESUNGEN 46
4. ERGEBNISSE
4.1. HERSTELLUNG REKOMBINANTER SHP-1 49
4.2. BESTIMMUNG DER SHP-1 BINDUNGSSTELLE AM EGFR 51
4.2.1. BEWEIS DER DIREKTEN BINDUNG ZWISCHEN SHP-1 UND EGFR 51
4.2.2. BINDUNG VON SHP-1 AN EGFR-ABGELEITETE PHOSPHOPEPTIDE 53
4.2.3. ANALYSE VON EGFR YF-MUTANTEN 54
4.3. AUSWIRKUNGEN VERMINDERTER ODER ERHOEHTER SHP-1-EGFR-INTERAKTION 56
AUF DIE SIGNALAKTIVITAET DES REZEPTORS
4.4. CHARAKTERISIERUNG EINES PHOSPHORYLIERTEN SHP-1
-INTERAKTIONSPARTNERS 59
(PPLOO)
4.5. ANSAETZE ZUR PROTEINCHEMISCHEN IDENTIFIZIERUNG VON PPLOO 61
4.5.1. 2D-GELELEKTROPHORESE UND MASSFMGERPRINT-ANALYSEN 61
4.5.2. ETABLIERUNG EINER SAEULENCHROMATOGRAPHISCHEN REINIGUNG VON PPLOO
64
4.5.3. IDENTIFIZIERUNG VON PPLOO 65
4.6. DIE INTERAKTION VON SHP-1 MIT VAV2 66
4.6.1. BINDUNGSSTUDIEN 66
4.6.2. FUNKTIONELLE KONSEQUENZEN DER VAV2-SHP-1 -INTERAKTION 68
4.7. DIE INTERAKTION VON SHP-1 UND P 120CTN 72
4.7.1. BINDUNGSSTUDIEN 72
4.7.2. ANALYSE DER PHOSPHORYLIERUNG VON PL20CTN 76
4.7.3. DEPHOSPHORYLIERUNG VON P!20CTN DURCH SHP-1 78
4.7.4. EINFLUSS VERAENDERTER P 120CTN-PHOSPHORYLIERUNG AUF DIE E-CADHERIN-
79
VERMITTELTE ZELL-ZELL-ADHAESION
4.7.5. P 120CTN IN "VIABLE MOTHEATEN"-MAEUSEN 80
4.8. DIE EXPRESSION VON SHP-1 IN ZELLINIEN UND GEWEBEN 81
4.9. DIE INTERAKTION VON SHP-1 UND ROS 82
4.9.1. BINDUNGSSTUDIEN 82
4.9.2. CHARAKTERISIERUNG EINER STABIL TRANSFIZIERTEN NIH3T3 TRKA-ROS- 84
SHP-L-ZELLINIE
4.9.3. BIOLOGISCHE ASPEKTE DER ROS-SHP-1-INTERAKTION 87
5. DISKUSSION
5.1. SHP-1 MODULIERT DEN SIGNAL WEG VON EGFR 90
5.1.1. DER MECHANISMUS DER SHP-1 -EGFR-INTERAKTION 90
5.1.2. AUSWIRKUNGEN ERHOEHTER UND VERRINGERTER EGFR-SHP-1 -INTERAKTION
AUF 93
DIE SHP-1-VERMITTELTE REZEPTORDEPHOSPHORYLIERUNG
5.1.3. EINFLUSS DER EGFR-DEPHOSPHORYLIERUNG AUF DIE EGF-ABHAENGIGE MAPK-
95
AKTIVIERUNG
5.2. IDENTIFIZIERUNG VON PP 100 - EINEM MOEGLICHEN ADAPTORPROTEIN FUER
SHP-1 96
IN EPITHELZELLEN - DURCH "PROTEOMTECHNIK"
5.3. VAV2 ALS MOEGLICHES SHP-1-TARGET BEI DER REGULATION DER STRESSANTWORT
99
VON ZELLEN
5.4. P 120CTN - EIN NEUES TARGET FUER SHP-1 IN EPITHELIALEN ZELLEN 101
5.5. DIE INTERAKTION VON SHP-1 UND ROS 106
6. AUSBLICK
109
7. REFERENZEN
111
ANHANG
ABKUERZUNGEN
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG
ERKLAERUNG ZUR BEWERBUNG |
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