Untersuchungen zur Faltung der g-UntereinheitGamma-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins und Lokalisation des a-Faktor-RezeptorsAlpha-Faktor-Rezeptors der Hefe in vivio:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2000
|
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| Beschreibung: | Köln, Univ., Diss., 2000 |
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INHALT
1
EINLEITUNG
.
7
1.1
SIGNALTRANSDUKTION
UND
G-PROTEINE.
.
1
1.2
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
PROTEINWECHSELWIRKUNGEN
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
.
8
1.2.1
DIE
YYSPLIT-UBIQUITM-TECHNIK
"
.
9
13
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT.
.
13
2
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
14
2.1
ABKUERZUNGEN
.
14
2.1.1
AMINOSAEUREN
.
.14
2.2
MATERIALIEN
.
15
2.2.1
CHEMIKALIEN
.
15
2.2.2
GEBRAUCHSWAREN
.
15
2.2.3
BAKTERIENSTAMME
.
16
2.2.4
VEKTOREN
(PLASMIDE)
.
16
2.2.5
HAEUFIG
VERWENDETE
MEDIEN
UND
PUFFER
.
20
2.2.6
HEFESTAEMME
.
21
2.2.7
STOCKLOESUNGEN
.
21
23
METHODEN
.
22
2.3.1
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
BAKTERIEN
.
22
2.3.2
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
VON
CHEMISCH
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
23
2.3.3
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
VON
ELEKTROKOMPETENTER
BAKTERIEN
.
24
2.3.4
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
24
2.3.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
27
2.3.6
MUTAGENESE
UND
SCREEN
.
27
2.3.7
DNA-SEQUENZIERUNG
.
28
2.3.8
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
HEFEN
.
29
2.3.9
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
HEFEZELLEN
.
30
2.3.10
INDUKTION
DURCH
A-FAKTOR
.
30
2.3.11
DIE
SS-GALAKTOSIDASE-ANALYSE
.
31
2.3.12
GENAUSLOESCHUNG
MITTELS
LOXP-KANMX-LOXP
.
31
2.3.13
INDUKTION
VON
PROMOTOREN
.
33
2.3.14
HERSTELLUNG
VON
GESAMTPROTEINEXTRAKTEN
AUS
HEFEN
.
34
2.3.15
BESTIMMUNG
DER
GESAMTPROTEINKONZENTRATION
.
34
2.3.16
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-SDS-GELELEKTROPHORESE
.
35
2.3.17
COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
36
2.3.18
HALBTROCKEN-ELEKTROBLOTVERFAHREN
VON
PROTEINEN
.
36
2.3.19
PONCEAU-S-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
.
37
2.3.20
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
.
37
2.3.21
BILDBEARBEITUNG
.
38
3
ERGEBNISSE
.
39
3.1
FALTUNG
VON
G
R
(STELSP)
IN
AN
UND
ABWESENHEIT
VON
G
P
(STE4P)
.
39
3.1.1
EXPERIMENTELLE
VORGEHENSWEISE
.
39
3.1.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
HA-STE4P
.
43
1.1.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
STE
1
8P
UND
STE
1
8
CL06S
P
.
45
3.1.3
MESSUNG
DER
RELATIVEN
DISTANZ
ZWISCHEN
N
UND
C-TERMINUS
VON
GY
IN
VIVO
.
45
3.2
MESSUNG
DER
DURCH
DIE
BINDUNG
AN
DIE
SS-VNTEREINHEIT
INDUZIERTEN
FALTUNG
VON
STEL8P
.
48
3.2.1
SPEZIFITAETSMESSUNGEN
DER
STE4P-STE
1
8P-INTERAKTION
.
51
3.2.2
BINDUNG
VON
STELSSP
AN
DAS
STE4P-PROTEIN
.
53
3.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
STEL8P-MUTANTEN
.
55
3.2.4
ANALYSE
VERSCHIEDENER
STEL8P-MUTANTEN
IN
AN
UND
ABWESENHEIT
VON
STE4P
.
56
3.2.5
KONFORMATIONSKOMPETENZ
DURCH
CHAPERONE
-
STEL8P
UND
DAS
CHAPERONHSP
104P
.
59
3.2.6
KARTIERUNG
DES
STE4P-BINDUNGSBEREICHS
FUER
STEL8P
.
62
33
MUTANTENSCREEN
ZUR
ANALYSE
STRUKTURSTABILISIERENDEN
MUTATIONEN
IN
STEL8P.
.
63
3.4
MESSUNG
DER
ZELLULAEREN
VERTEILUNG
DES
A-FAKTOR-REZEPTORS
MITTELS
DER
SPLIT
UB-TECHNIK
_
_
68
3.4.1
EXPERIMENTELLE
VORGEHENSWEISE
.
68
3.4.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
STE2-CRUP
.
69
3.4.3
DIE
ZELLULAERE
VERTEILUNG
VON
STE2-CRUP
.
71
3.4.4
FUNKTIONALITAET
DER
PROTEINE
.
75
3.4.5
FUR4P
ALS
VERGLEICHSSTANDARD
FUER
STE2P
.
75
3.4.6
LOKALISATION
VON
STE2P
IN
DER
MATA-HEFEZELLE
.
76
3.4.7
LOKALISATION
VON
STE2P
IN
DER
MATA-HEFEZELLE
.
78
3.4.8
LOKALISATION
VON
STE2P
IN
MATA/A-HEFEZELLEN
.
79
3.4.9
ANALYSE
DER
LOKALISATION
UNTERSCHIEDLICHER
C-TERMINALE
MUTATIONEN
DES
STE2P
MOLEKUELS
.
80
4
DISKUSSION
.
85
4.1
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
DISTANZ
ZWISCHEN
N
UND
C-TERMINUS
VON
GY
.
85
4.2
MESSUNG
DER
DURCH
DIE
BINDUNG
AN
DIE
SS-UNTEREINHEIT
INDUZIERTE FALTUNG
VON
STEL8P
.
.
86
43
BINDUNG
VON
STEL8P
AN
STE4P.
.
88
4.4
MUTANTENSCREEN
ZUR
ANALYSE
STRUKTURSTABILISIERENDEN
MUTATIONEN
IN
STEL8P.
.
91
4.5
MESSUNG
DER
ZELLULAEREN
VERTEILUNG
DES
A-FAKTOR-REZEPTORS
MITTELS
DER
SPLIT
UB-TECHNIK
.
_
.
.
92
4.6
AUSBLICK
.
99
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
100
6
LITERATUR.
.
101
7
ANHANG
.
115 |
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