Ca 2+ und pH: Ionenmessungen in Zellen und Geweben
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Heidelberg [u.a.]
Spektrum, Akad. Verl.
2000
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| Schriftenreihe: | Labor im Fokus
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Inhalt
' Einleitung 11
1 Elektrochemische Grundlagen und die Verteilung von Ionen
über der Zellmembran 13
1.1 Ionen 13
1.2 Ionen in Lösungen 14
1.3 Ionen als Ladungsträger 15
1.4 Verteilung und Gradienten von Ionen 18
1.5 Literatur 19
2 Fluoreszenz ionensensitiver Farbstoffe 21
2.1 Fluoreszenz 22
2.1.1 Absorption von Photonen 22
2.1.2 Spontane Emission und Fluoreszenzstrahlung 23
2.1.3 Triplettzustände und Bleichen 26
2.1.4 Fluoreszenzspektrophotometer 27
2.2 Fura 2 28
2.2.1 Struktur 28
2.2.2 AM Ester 29
2.2.3 Messprinzip 30
2.3 BCECF 33
2.3.1 Membrangängigkeit 34
2.3.2 Absorptionsspektrum und pH Abhängigkeit 34
2.4 Messverfahren mit zwei Wellenlängen 36
2.4.1 Die Messung der Ca2+ Konzentration mit Fura 2 37
2.4.2 Wann bringt das 2/1 Verfahren keinen Vorteil? 39
2.4.3 2/1 Verfahren sind auf der Anregungs und der
Emissionsseite möglich 40
2.4.4 Messung relativer Fluoreszenzintensitäten 44
2.4.5 Messung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen 45
2.4.6 Welches Verfahren ist am vorteilhaftesten? 45
2.5 Literatur 46
3 Messaufbau für Fluoreszenzmessungen 49
3.1 Wahl des Mikroskops 50
3.2 Anregung der Fluoreszenz 52
: 3.2.1 Lichtquellen 53
3.2.2 Umschalten der Wellenlänge 55
6 Ca:+ und pH
3.3 Detektion der Fluoreszenz 59
3.3.1 Transmission des Mikroskops 60
3.3.2 Photodetektoren 61
3.4 Messapparaturen 66
3.4.1 Messungen ohne räumliche Auflösung 66
3.4.2 Imaging 66
3.4.3 Konfokale Laserrastermikroskopie 69
3.4.4 Zwei Photonen Laserrastermikroskopie 71
3.4.5 Nahfeldmikroskopie 73
3.4.6 Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) 73
3.5 Literatur 74
4 Calcium Imaging. Protokolle und Ergebnisse 77
4.1 Eichung von Ca2+ Messungen mit Fura 2 77
4.2 Messungen der Ca2+ Konzentration bei nur einer Anregungs¬
wellenlänge 83
4.3 Messungen der intrazellulären Ca2+ Konzentration mit einem
Laserrastermikroskop 84
4.3.1 Möglichkeiten und Einschränkungen 84
4.3.2 Eichung 86
4.3.3 Lokalisation von Calciumkanälen 86
4.3.4 Linescan Messungen 88
4.4 Ca2+ Flux und fraktionale Ca2+ Permeabilität 88
4.4.1 Ca2+ Flux 88
4.4.2 Fraktionale Ca2+ Permeabilität 92
4.5 AM Ester von Fluorophoren 95
4.5.1 Inkubation in AM Ester 95
4.5.2 Ca2+ Freisetzung aus Ca2+ Speichern 97
4.6 Literatur 99
5 Ionenselektive Mikroelektroden 101
5.1 Eigenschaften ionenselektiver Mikroelektroden 102
5.1.1 Ionenselektive Membranen 102
5.1.2 Selektivität 103
5.1.3 Detektion und Auflösung 105
5.1.4 Antwort verhalten 105
5.1.5 Stabilität 107
5.1.6 Lebensdauer 107
5.2 Herstellung ionenselektiver Mikroelektroden 108
5.2.1 Glasmikropipetten 108
5.2.2 Ausziehen von Elektroden 109
5.2.3 Beschichtung mit Silan („Silanisierung") 111
5.2.4 Füllen der Elektroden 113
Inhalt 7
5.2.5 Referenzelektrode 115
5.2.6 Herstellung ionenselektiver Mikroelektroden kurz
zusammengefasst 116
5.3 Kalibrierung ionenselektiver Mikroelektroden 116
5.3.1 Kalibrierungslösungen 116
5.3.2 Elektrodenantwort 117
5.3.3 Kalibrierung 118
5.4 Messung mit ionenselektiven Mikroelektroden 121
5.4.1 Messplatz 121
5.4.2 Extrazelluläre Anwendung 122
5.4.3 Intrazelluläre Anwendung 124
5.5 Fehlersuche („Trouble Shooting") 125
5.5.1 Beim Elektrodentest 125
5.5.2 Elektrode antwortet zu schwach 126
5.6 Literatur 127
6 H+ Messungen: Protokolle, Ergebnisse und
Interpretationen 129
6.1 Puffer und Puffersysteme 130
6.1.1 Intrinsische und bicarbonatabhängige H+ Pufferung 130
6.1.2 H+ Verteilung in Zellen und Geweben 135
6.2 Extrazelluläre pH Messungen mit ionenselektiven Mikro¬
elektroden 137
6.2.1 Elektrodeneinstich in ein Gewebe 137
6.2.2 Messung extrazellulärer pH Änderungen 139
6.3 Intrazelluläre pH Messungen mit ionenselektiven
Mikroelektroden 140
6.4 Intrazelluläre pH Messungen mit ionenselektiven
Farbstoffen 143
6.4.1 Farbstoffbeladung 143
6.4.2 Messungen mit Farbstoff und Mikroelektrode 146
6.4.3 Kalibrierung eines pH sensitiven Fluoreszenzsignals 147
6.4.4 Messbeispiel mit BCECF 148
6.5 Andere Farbstoffe und Anwendungen 150
6.6 Literatur 151
Firmenliste 153
Index 159 |
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