Expression der Farnesyltransferase aus verschiedenen Organismen in E. coli und Durchführung kinetischer Messungen:
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1999
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
THEORETISCHER
TEIL
3
2.1
PRENYLTRANSFERASEN
3
2.2
DAS
ENZYM
FARNESYLTRANSFERASE
3
2.3
BIOLOGISCHE
FUNKTION
DER
FTASE
4
2.4
RAS-PROTEINE
6
2.5
DER
RAS/MAP-KINASE
SIGNALTRANSDUKTIONSWEG
6
2.6
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIZIERUNG
VON
RAS-PROTEINEN
8
2.7
INHIBITOREN
DER
FTASE
9
2.7.1
SCREENING
VON
SUBSTANZBIBLIOTHEKEN
9
2.7.2
SUBSTRATANALOGA
10
2.7.3
BISUBSTRATANALOGA
14
2.8
SCHLUSSBETRACHTUNG
15
3
AUFGABENSTELLUNG
17
4
MATERIAL
19
4.1
GERAETE
UND
HILFSMITTEL
-
19
4.2
STANDARDCHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
20
4.3
ENZYME
20
4.4
VEKTOREN
21
4.4.1
PLASMIDE
FIIR
E.COLI
21
4.4.2
VEKTOREN
FUER
COEXPRESSION
MIT
PT7-7
21
4.4.3
HEFEVEKTOREN
21
4.5
ZELLSTAEMME
21
4.6
KITS
FUER
MIKROBIOLOGISCHE
ARBEITEN
22
4.7
OLIGONUKLEOTIDE
(YYPRIMER
"
)
22
4.8
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
22
4.9
RADIOCHEMIKALIEN
22
4.10
KULTURMEDIEN
23
4.11
PUFFER
UND
STAMMLOESUNGEN
24
4.11.1
ELEKTROPHORESEPUFFER
24
4
112
PUFFER
FUER
DIE
GST-CIIS
ISOLIERUNG
25
4
11.3
PUFFER
FUER
DIE
FTASE
ISOLIERUNG
AUS
S.
CEREVISIAE
25
II
4.11.4
LOESUNGEN
FUER
SDS-PAGE
26
4.11.5
LOESUNGEN
FUER
SEQUENZIERGELE
26
4.11.6
LOESUNGEN
FUER
WESTEM-BLOT
26
4.117
STAMMLOESUNGEN
27
4.12
SONSTIGES
29
5
METHODEN
31
5.1
STERILTECHNIK
31
5.2
MIKROBIOLOGISCHE
ARBEITEN
31
5.2.1
ANLEGEN
EINER
GLYCERINKULTUR
31
5.2.2
AUSSTRICH
EINER
GLYCENNKULTUR
AUF
EINER
AGARPLATTE
31
5.2.3
ANSETZEN
EINER
UEBEMACHTKULTUR
(UENK)
32
5.3
DNA-ARBEITSTECHNIKEN
32
5.3.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
32
5.3.2
BEHANDLUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
32
5.3.3
DNA-FRAGMENTANALYSE
MIT
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
33
5
3.4
DNA
EXTRAKTION
AUS
AGAROSEGELEN
34
5.3.5
DEPHOSPHOIYLIENMG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
(CIAP)
34
5.3.6
LIGATION
VON
DNA
FRAGMENTEN
35
5.3.7
EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
MIT
PHENOL/CHLOROFORM
36
5.3.8
ETHANOLPRAEZIPITATION
VON
NUKLEINSAEUREN
36
5.3.9
PCR
ZUR
DNA-AMPLIFIKATION
UND
EINFUEHRUNG
VON
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
36
5.3.10
PCR
ZUR
GENSYNTHESE
NACH
STEMMER
ET
AL.
37
5
3
11
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E
COLI
ZELLEN
38
5.3.12
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
E
COLI
ZELLEN
38
5.4
DNA-SEQUENZIERUNG
39
5.4.1
SEQUENZIERUNG
MIT
DEM
YYTHERMO
SEQUENASE
RADIOLABELED
TERMINATOR
CYCLE
SEQUENCING
KIT
"
VON
AMERSHAM
39
5
4.2
SEQUENZIERUNG
MIT
DEM
YYABI
PRISM
BIGDYE
TERMINATOR
CYCLE
SEQUENCING
READY
REAKTION
KIT
"
VON
PE,
APPLIED
BIOSYSTEMS
40
5
4.3
HERSTELLUNG
VON
SEQUENZIERGELEN
UND
DURCHFUEHRUNG
EINER
PAGE-ELEKTROPHORESE
40
5
44
IN
VITRO
TRANSLATION
41
5.5
PROTEINCHEMISCHE
ARBEITEN
42
5.5.1
ISOLIERUNG
DES
GST-CIIS
FUSIONSPROTEIN
42
5.5
2
EXPRESSION
DER
FTASE
IN
E.COLI
BL21
MIT
HILFE
DES
VEKTORS
PT7-7
43
5.5.3
ZELLAUFSCHLUSS
VON
E
COLI
ZELLEN
DURCH
ULTRASCHALL
43
5
5
4
ZELLAUFSCHLUSS
VON
E
COLI
ZELLEN
MIT
GLASKUGELN
43
5.5.5
ISOLIERUNG
DER
FTASE
AUS
S
CEREVISIAE
44
5.5.6
REINIGUNG
DER
FTASE
AUS
E
COLI
45
5.5
7
AKTIVITAETSTEST
DER
FTASE
46
5
5.8
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
47
5.5.9
SDS-POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
49
5.5.10
WESTEM-BLOT
UND
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
50
5.6
CHEMISCHER
TEIL
51
5.6
1
SYNTHESE
VON
N-DANSYL-S-FAMESYL-L-GLYCYL-L-CYSTEYL-L-VAHNYL-L-LEUCYL-L-SERIN
(N-DANSYL-S-FAR
GCVLS)
51
5.6.2
SYNTHESE
VON
TRANS,TRUNS-2,4-HEXADIENPYROPHOSPHAT
52
5.6.3
SYNTHESE
VON
TRANS,
TRAN?-2,4-NONADIENPYROPHOSPHAT
53
NI
6
ERGEBNISSE
55
6.1
KLONIERUNG
DER
BEIDEN
GENE
DPR]
UND
RAM2
DER
FTASE
AUS
S.CEREVISIAE
IN
DEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PT7-7
55
6.1.1
WAHL
DES
EXPRESSIONSSYSTEM
55
6
1.2
STRATEGIEN
ZUR
KLONIERUNG
DER
BEIDEN
FTASE
GENE
DPRL
UND
RAM2
IN
PT7-7
56
6.2
EXPRESSION
DER
FTASE
AUS
S.CEREVISIAE
IM
SYSTEM
PT7-7/E.CO//BL21
(DE3)
63
6.2.1
NACHWEIS
DER
FTASE
IM
ZELLROHEXTRAKT
63
6.2.2
VERGLEICH
DER
EXPRESSION
DER
VERSCHIEDENEN
TRANSLATIONAL
GEKOPPELTEN
DIMERE
63
6
2.3
OPTIMIERUNG
DER
INDUKTIONSZEIT
64
6.2.4
COEXPRESSION
DER
FTASE
AUS
S
CEREVISIAE
MIT
PROKARYOTISCHEN
CHAPERONE-PROTEINEN
IN
E
COLI
BL2
1
(DE3)
65
6.2.5
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
FTASE
AUS
E
COLI
BL2
1
(DE3)
69
6.3
IN
VITRO
TRANSLATION
DER
FTASE
AUS
S.CEREVISIAE
IN
E.COLI
BL21
(DE3)
71
6.4
ETABLIERUNG
UND
EICHUNG
DES
VON
POMPLIANO
ET
AL.
ENTWICKELTEN
AKTIVITAETSTEST
DER
FTASE
72
6.5
GENERIERUNG
EINES
SYNTHETISCHEN
GENS
DER
MENSCHLICHEN
FTASE
(HFTASE)
73
6.5.1
GENERIERUNG
DES
SYNTHETISCHEN
HFTASE
GENS
77
6.6
INHIBIERUNG
DER
FTASE
AUS
S.CEREVLSIAE
DURCH
N-RAS
LIPOPEPTIDE
85
6.7
INHIBIERUNG
DER
FTASE
AUS
SCEREVISIAE
DURCH
KONJUGIERTE
FPP-ANALOGA
86
7
DISKUSSION
89
8
ZUSAMMENFASSUNG
95
9
LITERATURVERZEICHNIS
97
10
ANHANG
101
10.1
DAS
PROGRAMMPAKET
YYHUSAR
"
101
10.2
PRIMER
ZUR
SYNTHESE
DES
KUENSTLICHEN
HFTASE
GENS
101
10.2.1
PRIMER
DES
PLUSSTRANGES
101
10
2.2
PRIMER
DES
MINUSSTRANGES:
104
10.3
SPEKTRENANHANG
107
10.3.1
ESI-MASSENSPEKTRUM
VON
N-DANSYL-S-FAR-GCVLS
107 |
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| topic_facet | Escherichia coli Enzymaktivität Heterologe Genexpression Farnesyltransferase Farnesyltranstransferase Hochschulschrift |
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