Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion des Hüllproteins des Humanen Foamyvirus:
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| Format: | Buch |
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2000
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.1
1.1. RETROVIREN.1
1.1.1. AUFBAU UND GENEXPRESSION.2
1.1.2. REPLIKATION.5
1.1.3. MORPHOGENESE. 7
1.2. FOAMYVIREN.10
1.2.1. GENEXPRESSION UND GENPRODUKTE.11
1.2.2. DAS HFV HUELLPROTEIN.14
1.2.3. BESONDERHEITEN DER FOAMYVIRALEN REPLIKATION.16
1.3. FRAGESTELLUNG.
19
2. MATERIAL UND METHODEN.20
2.1. MATERIAL.20
2.1.1. GERAETE UND MATERIALIEN.20
2.1.2. CHEMIKALIEN.21
2.1.3. ENZYME UND KITS.21
2.1.4. RADIOCHEMIKALIEN.22
2.1.5. PROTEASE INHIBITOREN.
F.22
2.1.6. ANTISEREN UND ANDERE NACHWEISREAGENZIEN.22
2.1.7. ANTIBIOTIKA.23
2.1.8. BAKTERIENSTAEMME.23
2.1.9. PLASMIDE.24
2.1.10. LOESUNGEN.24
2.1.10.1. BAKTERIENKULTUR.24
2.1.10.2. LOESUNGEN ZUR ANALYSE UND KLONIERUNG VON DNA.25
2.1.10.3. DNA TRANSFEKTION.27
2.1.10.4. LOESUNGEN FUER PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.28
2.1.10.5. ZELLKULTUR.30
2.1.10.6. STANDARDLOESUNGEN UND PUFFER.33
2.2. METHODEN
35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1. ANALYSE UND KLONIERUNG VON DNA.35
2.2.1.1. HERSTELLUNG TRANSFONNATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN.35
2.2.1.2. TRANSFORMATION.35
2.2.1.3. ISOLIERUNG VON PLASMID DNA AUS BAKTERIEN (MINI-BZW.
MIDI-PRAEPARATION).36
2.2.1.4. ISOLIERUNG VON DNA AUS SAEUGERZELLEN MIT DEM QIAMP-TISSUE KIT.37
2.2.1.5. SPEKTROPHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN.38
2.2.1.6. SEQUENZIERUNG VON PLASMID DNA MIT AMPLITAQFS.38
2.2.1.7. SEQUENZIERUNG VON PCR PRODUKTEN. 3*1
2.2.1.8. RESTRIKTIONSVERDAUS.39
2.2.1.9. AGAROSE GELELEKTROPHORESE.39
2.2.1.10. PRAEZIPITATION VON DNA.40
2.2.1.11. EXTRAKTION VON DNA MIT PHENOL BZW. CHLOROFORM.40
2.2.1.12. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA MIT C1AP.41
2.2.1.13. AUFFULLEN VON UEBERHAENGENDEN 5' ENDEN MIT DEM KLENOW ENZYM.41
2.2.1.14. POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR). 41
2.2.1.15. ELUTION VON DNA FRAGMENTEN MIT DEM GENECLEAN KIT.42
2.2.1.16. ELUTION VON DNA FRAGMENTEN MIT DEM MERMAID KIT.43
2.2.1.17. LIGATION LINEARER DNA FRAGMENTE MIT T4 LIGASE.43
2.2.2. PROTEINEXPRESSION UND ANALYSE IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN.43
2.2.2.1. CAPO TRANSFEKTION.43
2.2.2.2. HERSTELLUNG VON ZELLYSATCN.45
2.2.2.3. SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN (SDS-PAGE).46
2.2.2.4. WESTERN BLOT.47
2.2.2.5. RADIOIMMUNOPRAEZIPITATION
(RIPA).48
2
.
22
.
6
.
VIRUSPARTIKELPRAEPARATION AUS ZELLKULTURUEBERSTAENDEN.49
2.2.2.7. YYPULSE-CHASE" ANALYSE.,.50
2.2.2.8. ENDOH VERDAU VON PROTEINEN.51
2.2.2.9. BIOTINYLIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN.52
2.2.3. ZELLKULTUR.53
2.2.3.1. KULTIVIERUNG VON SAEUGERZELLEN.53
2.2.3.2. GENERIERUNG VIRALER UEBERSTAENDE ZUR TRANSDUKTION VON
ZIELZELLEN.54
2.2.3.3. SUBKLONIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN DURCH YYLIMITING
DILUTION".55
2.2.3.4. GENERIERUNG REKOMBINANTER HFV UEBERSTAENDE.56
2.2.3.5. TITRIERUNG VON HF-VIRUSUEBERSTAENDEN.58
2.2.3.6. BESTIMMUNG VON INFEKTIONSEFFIZIENZEN NACH TRANSFEKTION VON HFV
VEKTOREN.59
2
.
22
.
1
.
FUSIONSASSAY.59
3. ERGEBNISSE.61
3.1. ROLLE DES HFV HUELLPROTEINS BEI DER VIRUSPARTIKELFREISETZUNG,
61
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1. ANALYSE DER PSEUDOTYPISIERBARKEIT VON HFV KAPSIDEN.61
3.1.1.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE FUER HETEROLOGE UND CHIMAERE
HUELLPROTEINE.61
3.1.1.2. ZELLULAERE EXPRESSION CHIMAERER UND HETEROLOGER HUELLPROTEINE.65
3.1.1.3. RELATIVE TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ CHIMAERER UND HETEROLOGER
HUELLPROTEINE.66
3.1.1.4. ANALYSE DER PAITIKELFREISETZUNG MIT CHIMAEREREN UND HETEROLOGEN
HUELLPROTEINEN.67
3.1.2. BEDEUTUNG C-TERMINALER BEREICHE VON HFV ENV FUER DIE
PARTIKELFREISETZUNG .69
3.1.2.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE FUER HFV ENV-DELETIONSMUTANTEN.69
3.1.2.2. ZELLULAERE EXPRESSION DER HFV ENV-DELETIONSMUTANTEN.70
3.1.2.3. RELATIVE TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ DER HFV
ENV-DELETIONSMUTANTEN.71
3.1.2.4. ANALYSE DER PARTIKELFREISETZUNG MIT HFV
ENV-DELETIONSMUTANTEN.72
3.1.2.5. EXPRESSIONSKONSTRUKTE FUER HETEROLOG MEMBRANVERANKERTE HFV
HUELLPROTEINE.73
3.1.2.6. ZELLULAERE EXPRESSION HETEROLOG VERANKERTER HFV HUELLPROTEINE.74
3.1.2.7. RELATIVE TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ HETEROLOG VERANKERTER HFV
HUELLPROTEINE.75
3.1.2.8. ANALYSE DER PARTIKELFREISETZUNG MIT HETEROLOG VERANKERTEN HFV
HUELLPROTEINEN.76
3.1.3. ROLLE KONSERVIERTER AMINOSAEUREN INNERHALB DER MSD VWI HFV ENV BEI
DER
PARTIKELFREISETZUNG.76
3.1.3.1. EXPRESSIONSKONSTRUKTE VON HFV ENV-MSD-PUNKTMUTANTEN.77
3.1.3.2. ANALYSE DER PARTIKELFREISETZUNG MIT HFV
ENV-MSD-PUNKTMUTANTEN.79
3.1.3.3. RELATIVE TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ DER HFV
ENV-MSD-PUNKTMUTANTEN.81
3.1.4. STABILITAET AUSGEWAEHLTER HFV HUELLPROTEINMUTANTEN.82
3.1.5. ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN ZUR PARTIKELMORPHOGENESE.84
3.2. EINFLUSS C-TERMINALER MUTATIONEN AUF FUSIONSAKTIVITAET UND TRANSPORT
VON HFV
ENV.88
3.2.1. EINFLUSS VON MUTATIONEN IN DER HFV ENV-MSD AUF DIE
FUSIONSAKTIVITAET.88
3.2.1.1. ASSAY ZUR BESTIMMUNG DER FUSIONSAKTIVITAET VON HFV
HUELLPROTEINEN.88
3.2.1.2. QUANTIFIZIERUNG DER FUSIONSAKTIVITAET VERSCHIEDENER MSD-MUTANTEN
UND DELETIONSMUTANTEN.90
3.2.2. AUSWIRKUNGEN VON MUTATIONEN AUF DEN TRANSPORT VON HFV ENV.92
3.2.2.1. ANALYSE DER OBERFLAECHENEXPRESSION VERSCHIEDENER HFV
HUELLPROTEINMUTANTEN.92
3.2.3. EINFLUSS DER KOEXPRESSION VON HFV-GAG/POL AUF DIE
FUSIONSAKTIVITAET.96
3.2.3.1. QUANTIFIZIERUNG DER FUSIONSAKTIVITAET VERSCHIEDENER HFV
ENV-MUTANTEN MIT UND OHNE GAG/POL.96
4. DISKUSSION.98
4.1. ROLLE DES HFV HUELLPROTEINS BEI DER VIRUSPARTIKELFREISETZUNG.100
4.2. FUSIONSAKTIVITAET DES HFV HUELLPROTEINS
105
INHALTSVERZEICHNIS
5. LITERATURVERZEICHNIS.111
6. ANHANG.118
6.1. ZUSAMMENFASSUNG.118
6.2. SUMMARY.120
6.3. ABBILDUNGSVEIZEICHNIS.122
6.4. TABELLENVERZEICHNIS.123
6.5. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.124
6.6. ERKLAERUNGEN. 125
6.7. LEBENSLAUF.126
6.8. PUBLIKATIONSLISTE
127 |
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